高迁移率族蛋白1促进丙型肝炎病毒复制的机制研究

发布时间：2017-09-30 12:12

  本文关键词：高迁移率族蛋白1促进丙型肝炎病毒复制的机制研究

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【摘要】：丙型肝炎病毒(HCV)病毒体呈球形,为单股正链RNA病毒,HCV感染可发展为慢性肝炎,肝硬化甚至肝癌。目前针对HCV感染尚无有效的保护性疫苗,并且针对HCV感染的治疗手段仍然有限。以往的报道证实许多宿主因子可能涉及丙型肝炎的发病机理,例如：La抗原,多聚胞嘧啶结合蛋白2 (PCBP2)等。高迁移率族蛋白1(HMGB1)作为高迁移率族蛋白家族的成员之一,是一种非组蛋白核蛋白。HMGB1由两个同源DNA结合结构域和一个高度带负电荷的羧基端结构域组成,有报道表明HMGB1可以结合DNA,也可结合双链RNA和免疫性RNA作为核酸介导的先天性免疫反应广泛传感器。尽管在最近报道称由病毒感染的细胞释放出来的HMGB1可阻止HCV感染,但细胞内的HMGB1在HCV复制和(或)翻译中所起的作用并不知道。在本课题中,我们研究了高速迁移族蛋白1对HCV复制和翻译的影响。我们发现在HCV感染的细胞中,过表达HMGB1时,HCV的RNA水平和蛋白水平随之显著性的升高；敲除HMGB1时,HCV的RNA水平和蛋白水平也随之显著性的降低。随后,我们运用HCV双顺反子质粒系统(pRL-HL)和HCV IRES RNA报告系统探讨HMGB1对HCV翻译的影响,结果表明HMGB1不作用于HCV的翻译过程。免疫荧光结果显示HCV感染的肝细胞中HMGB1由胞核转移至胞质,通过免疫沉淀和RNA结合蛋白免疫共沉淀实验证实,HMGB1与HCV正链RNA结合。进一步的实验表明：HMGB1是通过A box结构域与HCV 5'UTR的茎环结构4(SL4)相互作用,从而起到促进HCV复制的作用。这些结果表明了HMGB1是一种HCV RNA结合蛋白,且作为促病毒因子促进HCV感染。
【关键词】：丙型肝炎病毒(HCV) 高迁移率族蛋白1 5’非翻译区(5’UTR) 病毒复制
【学位授予单位】：湖南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R512.63
【目录】：

• 摘要5-6
• Abstract6-10
• 第1章 绪论10-18
• 1.1 丙型肝炎病毒概述10-14
• 1.1.1 丙型肝炎病毒的发现及流行病学10-11
• 1.1.2 HCV的结构与功能11-13
• 1.1.3 HCV新药物研发进展13-14
• 1.2 HMGB1蛋白的研究进展14-16
• 1.2.1 HMGB1蛋白的结构14-15
• 1.2.2 HMGB1蛋白的功能15-16
• 1.3 本课题的研究方案及目的16-18
• 第2章 HMGB1对HCV的影响18-41
• 2.1 前言18
• 2.2 实验材料18-19
• 2.2.1 实验耗材与试剂18-19
• 2.2.2 主要实验仪器和设备19
• 2.3 实验方法19-31
• 2.3.1 特异性HMGB1-shRNA的制备19-22
• 2.3.2 HMGB1过表达载体质粒的制备22-23
• 2.3.3 细胞培养23-24
• 2.3.4 质粒转染及RNA转染24-25
• 2.3.5 RNA的提取25-26
• 2.3.6 逆转录PCR(Reverse Transcription PCR)26-27
• 2.3.7 荧光定量PCR(SYBR Green法)27-28
• 2.3.8 蛋白质的提取28
• 2.3.9 蛋白质浓度的测定(Bio-Rad试剂盒)28
• 2.3.10 蛋白免疫印迹(Western Blot)28-31
• 2.3.11 细胞活力测定实验(MTS)31
• 2.3.12 统计学分析31
• 2.4 实验结果31-40
• 2.4.1 特异性HMGB1-shRNA沉默效果鉴定31-32
• 2.4.2 特异性p3×FLAF-CMV-HMGB1过表达效果鉴定32-33
• 2.4.3 HMGB1对HCV的影响33-35
• 2.4.4 HMGB1对HCV复制和翻译的影响35-37
• 2.4.5 胞内外HMGB1对HCV起着不同的功能作用37-40
• 2.5 小结与讨论40-41
• 第3章 HMGB1与HCV正链5'UTR茎环结构4相结合41-58
• 3.1 前言41
• 3.2 实验材料41-42
• 3.2.1 实验耗材与试剂41-42
• 3.2.2 主要实验仪器和设备42
• 3.3 实验方法42-49
• 3.3.1 引物设计42
• 3.3.2 免疫荧光(Immunofluorescence)实验步骤42-44
• 3.3.3 激光共聚焦44-45
• 3.3.4 免疫共沉淀45-46
• 3.3.5 Western Blot实验步骤46
• 3.3.6 RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)46-48
• 3.3.7 细胞培养48
• 3.3.8 细胞转染48
• 3.3.9 体外转录(Ambion试剂盒)48-49
• 3.3.10 统计学分析49
• 3.4 实验结果49-56
• 3.4.1 HMGB1蛋白与HCV正链RNA相结合49-52
• 3.4.2 HCV 5’UTR为HMGB1的结合区域52-55
• 3.4.3 HMGB1蛋白与HCV 5’UTR茎环结构4(SL4)相互作用55-56
• 3.5 小结与讨论56-58
• 第4章 HMGB1 A box是HCV 5'UTR的结合区域及关键功能区域58-70
• 4.1 前言58-59
• 4.2 实验材料59
• 4.2.1 实验耗材与试剂59
• 4.2.2 主要实验仪器和设备59
• 4.3 实验方法59-65
• 4.3.1 HMGB1分段过表达质粒的构建59-64
• 4.3.2 HMGB1分段过表达质粒的表达鉴定64
• 4.3.3 细胞转染64
• 4.3.4 RNA结合蛋白免疫共沉淀(RIP)64
• 4.3.5 免疫共沉淀64
• 4.3.6 逆转录PCR64
• 4.3.7 荧光定量PCR(SYBR Green法)64
• 4.3.8 统计学分析64-65
• 4.4 实验结果65-69
• 4.4.1 重组质粒的构建65-66
• 4.4.2 HMGB1各分段与HCV 5’UTR RNA之间的作用66-68
• 4.4.3 HMGB1蛋白各分段在促进病毒复制中的作用68-69
• 4.5 小结与讨论69-70
• 结论70-73
• 参考文献73-80
• 附录 攻读硕士学位期间所发表的学术论文80-81
• 致谢81-82

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本文编号：948122