基于纳米颗粒的乙肝表面抗原（HBsAg）核酸适体的筛选及其检测应用研究

发布时间：2017-10-02 07:36

  本文关键词：基于纳米颗粒的乙肝表面抗原（HBsAg）核酸适体的筛选及其检测应用研究

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【摘要】：乙型肝炎已成为严重威胁人类健康的世界性疾病,也是当前我国流行最广泛、危害最严重的一种疾病。中国是世界上乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染的高发区,目前全国约有1亿人为HBV携带者。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)是HBV感染后第一个出现的血清标志物,已成为诊断HBV感染的重要指标之一。核酸适体(aptamer)是一类新型的特异识别分子,被视为人工抗体。但与抗体相比,核酸适体稳定性好、没有免疫原性和毒性、能通过化学合成制备以及修饰、特异性强和亲和性高。这些优点使它有望取代和超过抗体,在生物医学以及化学分析等领域起着重要的作用。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技术即指数富集配体系统进化技术,利用该技术可从人工合成的随机单链寡核苷酸文库中体外筛选出特异与靶物质高度亲和的核酸适体。化学发光法具有灵敏度高、线性范围宽、操作简单和易自动化等优点,为疾病的分子检测提供了一个良好的平台。基于磁性纳米颗粒(magnetic nanoparticles, MNPs)的磁分离具有分离速度快、效率高、操作简单、易实现功能化和自动化、以及不影响分离物质的活性等优越的物理化学性质和生物相容性。纳米金可以作为生物分子的载体,能迅速、稳定地与核酸和蛋白质等生物分子结合,而几乎不影响这些分子的生物活性。而且以纳米金作探针载体,可以在纳米金上负载多个信号分子,从而对目标靶分子的检测信号进行放大。本论文首先采用羧基化磁性纳米颗粒为载体,SELEX筛选特异识别HBsAg的核酸适体,再将磁性纳米颗粒、金纳米颗粒、免疫分析、化学发光检测和核酸适体技术等进行有机结合,建立了新的高灵敏、快速且经济实用的HBsAg检测方法,为HBV感染的早期、快速检测诊断奠定基础。具体内容包括：1.纳米颗粒的制备、表面修饰与表征Fe304磁性纳米颗粒的制备采用软模板法制备,再采用经典Stober法并经改进后在Fe304颗粒表面包覆一层Si02,形成Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒。包硅后的Fe3O4@SiO2颗粒,需进一步与蛋白质、核酸适体和金纳米颗粒等结合,因此再对其进行氨基化、羧基化和巯基化等一系列表面化学修饰。金纳米颗粒采用柠檬酸钠还原法制备,并通过自组装技术制备金磁复合颗粒。所制备的Fe304颗粒呈圆形、大小比较均匀,粒径为450 nm左右,分散性很好,但是表面比较粗糙；改进后的方法所制备的Fe3O4@SiO2颗粒,在Fe304的表面清晰可见包覆有一层硅,表面变光滑,而且分散性良好；Fe3O4@SiO2颗粒具有很强的磁响应性,其磁饱和强度为43.86 emu/g;通过对Fe304颗粒、Fe3O4@SiO2颗粒、表面氨基修饰的Fe3O4@SiO2颗粒、以及表面羧基修饰的Fe3O4@SiO2颗粒分别进行Zeta电位测定,表明对Fe304颗粒的包硅、以及包硅后的氨基修饰和羧基修饰均很成功,为Fe3O4@SiO2颗粒作为载体进一步与蛋白质、核酸适体等物质结合奠定了基础。所制备的金纳米颗粒大小比较均匀,粒径为15 nm左右,其Zeta电位为负值,峰值为-42.7 my；巯基修饰的Fe3O4@SiO2颗粒与金纳米颗粒通过共价键结合、自组装为金磁复合颗粒,在Si02表面吸附有许多金纳米颗粒,但未形成明显的核壳结构；Fe3O4@SiO2@Au复合颗粒磁性略微有所下降,但仍然具有良好的磁响应性,其磁饱和强度为36.42 emu/g。2.不对称PCR扩增条件的优化核酸适体SELEX筛选过程中,每一轮筛选均需使用单链寡核苷酸文库与目标靶分子进行孵育,本论文采用不对称PCR扩增制备单链DNA文库,PCR反应体系为50μL。对Taq DNA聚合酶用量、上下游引物的比例、退火温度以及扩增轮数等条件进行了优化。优化后的不对称PCR扩增条件为：Taq DNA聚合酶用量1.5 U,上下游引物的比例90：1,退火温度68℃,扩增循环数30。以不对称扩增的ssDNA产物经纯化后作为下一轮筛选的文库重复进行筛选,直至筛选结束。3.以羧基化磁性纳米颗粒为载体的HBsAg核酸适体的筛选首先采用EDC、NHS两步法活化羧基化磁性纳米颗粒(Fe3O4@SiO2颗粒),然后将筛选靶分子HBsAg与活化后的羧基化磁性纳米颗粒进行偶联,随后与单链DNA文库进行孵育,再经过分离、洗脱和PCR不对称扩增制备单链DNA文库等过程筛选特异结合HBsAg的核酸适体。重复以上筛选过程,并对最后一轮筛选的产物进行克隆、测序以及二级结构分析。经过13轮筛选,随机挑选15个克隆进行测序,结果获得3个特异结合HBsAg的核酸适体,分别命名为H01、H02和H03,其中大部分序列为H01,表明特异结合HBsAg的高亲和性核酸适体筛选成功。而且在这3个核酸适体中,H01的亲和性最高,故选择H01进行下一步的HBsAg检测应用。4.基于磁分离和免疫分析的化学发光核酸适体传感器的构建及检测应用对筛选出的核酸适体H01进行氨基修饰,然后固定在羧基化MNPs表面,再捕获待检测样本中的HBsAg,磁分离后再分别与抗HBsAg的鼠一抗、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)标记的马抗鼠二抗孵育,最后磁分离获得所述的核酸适体传感器,用于催化AMPPD化学发光体系。用该核酸适体传感器对纯HBsAg蛋白和乙肝血清样本进行检测,结果表明：在1-200 ng/mL范围内,化学发光强度与HBsAg浓度具有良好的线性关系；通过利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作为对照,该核酸适体传感器对乙肝血清中的HBsAg具有很高的特异性；并且,该传感器对乙肝血清中的HBsAg的检测限可达0.1 ng/mL,低于国产ELISA试剂盒的检测限0.5 ng/mL。该核酸适体传感器与ELISA试剂盒相比较,具有快速磁分离、检测灵敏度高等优点,因此在HBsAg的临床检测中具有一定的应用价值。5.基于双功能化金纳米颗粒的化学发光核酸适体传感器的构建及检测应用上述构建的基于磁分离和免疫分析的化学发光核酸适体传感器不足之处在于磁性纳米颗粒对化学发光具有遮蔽作用,为了克服这一缺点,我们又构建了基于双功能化金纳米颗粒的化学发光核酸适体传感器。用该化学发光核酸适体传感器对纯HBsAg蛋白和乙肝血清样本进行检测,结果表明：在1-225 ng/mL范围内,化学发光强度与HBsAg浓度具有良好的线性关系；通过利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作为对照,该核酸适体传感器对乙肝血清中的HBsAg同样具有很高的特异性；并且,该传感器对乙肝血清中的HBsAg的检测限可达0.05 ng/mL,低于上一章构建的基于磁分离和免疫分析的核酸适体传感器的检测限0.1 ng/mL。
【关键词】：核酸适体 HBsAg 筛选 纳米颗粒 化学发光 检测
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R446.6;R512.62
【目录】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-15
• 缩略语15-17
• 第一章 绪论17-55
• 1.1 乙肝病毒及其检测方法研究进展18-21
• 1.1.1 乙肝病毒简介18-19
• 1.1.2 乙肝病毒检测方法19-21
• 1.2 磁性纳米颗粒和金纳米颗粒的合成及应用研究进展21-24
• 1.2.1 磁性纳米颗粒22-23
• 1.2.2 金纳米颗粒23-24
• 1.3 核酸适体的筛选与应用研究进展24-39
• 1.3.1 SELEX的基本原理和过程25-26
• 1.3.2 提高核酸适体选择性的SELEX改进方法26-28
• 1.3.3 高效SELEX筛选方法28-32
• 1.3.4 细胞SELEX32-34
• 1.3.5 核酸适体在生物医学中的应用34-39
• 1.4 化学发光39-41
• 1.5 研究目的和意义41-42
• 参考文献42-55
• 第二章 纳米颗粒的制备、表面修饰与表征55-73
• 2.1 引言55-56
• 2.1.1 Fe_3O_4磁性纳米颗粒表面改性及修饰55-56
• 2.1.2 金磁复合颗粒56
• 2.2 实验材料与方法56-60
• 2.2.1 实验试剂与仪器57-58
• 2.2.2 实验方法58-60
• 2.3 实验结果与讨论60-67
• 2.3.1 Fe_3O_4颗粒包SiO_2前后形貌及分散性60-61
• 2.3.2 Fe_3O_4颗粒包SiO_2前后粒径分布61-62
• 2.3.3 金纳米颗粒形貌和Zeta电位62-63
• 2.3.4 自组装型金磁复合颗粒形貌63-64
• 2.3.5 Fe_3O_4@SiO_2颗粒和金磁复合颗粒磁响应性64
• 2.3.6 Fe_3O_4颗粒表面各种修饰后Zeta电位变化64-66
• 2.3.7 纳米颗粒表面EDS元素分析66-67
• 2.4 本章小结67-68
• 参考文献68-73
• 第三章 以羧基化MNPs为介质的HBsAg核酸适体的筛选73-91
• 3.1 引言73-74
• 3.1.1 筛选靶分子HBsAg73
• 3.1.2 以羧基化MNPs为介质的SELEX筛选73-74
• 3.2 实验材料与方法74-81
• 3.2.1 实验试剂与仪器74-76
• 3.2.2 实验方法76-81
• 3.3 实验结果与讨论81-87
• 3.3.1 以微孔板为介质的SELEX筛选法摸索81
• 3.3.2 不对称PCR扩增条件优化81-83
• 3.3.3 每轮不对称PCR扩增产物电泳图83
• 3.3.4 亲和力测定83-84
• 3.3.5 核酸适体克隆、测序84-86
• 3.3.6 二级结构分析86
• 3.3.7 三个不同核酸适体的亲和性比较86-87
• 3.4 本章小结87
• 参考文献87-91
• 第四章 基于磁分离和免疫分析的化学发光核酸适体传感器检测HBsAg研究91-105
• 4.1 引言91-92
• 4.2 实验材料与方法92-96
• 4.2.1 实验试剂与仪器92-94
• 4.2.2 实验方法94-96
• 4.3 实验结果与讨论96-101
• 4.3.1 检测条件的优化96-99
• 4.3.2 对纯HBsAg蛋白的检测99
• 4.3.3 对乙肝血清样本中HBsAg的检测99-100
• 4.3.4 特异性实验100
• 4.3.5 检测系统可行性实验100-101
• 4.4 本章小结101
• 参考文献101-105
• 第五章 基于双功能化金纳米颗粒的化学发光核酸适体传感器检测HBsAg研究105-117
• 5.1 引言105-106
• 5.2 实验材料与方法106-109
• 5.2.1 实验试剂与仪器106-107
• 5.2.2 实验方法107-109
• 5.3 实验结果与讨论109-115
• 5.3.1 检测条件的优化109-112
• 5.3.2 对纯HBsAg蛋白的检测112-113
• 5.3.3 对乙肝血清样本中HBsAg的检测113
• 5.3.4 特异性实验113-114
• 5.3.5 检测系统可行性实验114-115
• 5.4 本章小结115
• 参考文献115-117
• 第六章 总结与展望117-119
• 附录119-121
• 致谢121

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