凝血酶切割骨桥蛋白在肝纤维化中的作用研究

发布时间：2017-10-04 05:33

  本文关键词：凝血酶切割骨桥蛋白在肝纤维化中的作用研究

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【摘要】：研究背景和目的肝脏纤维化是由于包括胶原蛋白在内的细胞外基质(extracellular matrix, ECM)蛋白的过度积累所导致的。肝脏纤维化可以发生在大部分的慢性肝脏疾病。目前,纤维化被认为是机体的一种应答反应,是机体对慢性肝脏疾病导致的肝脏反复损伤的一个损伤-修复反应,同时伴随修复和再生的过程。肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化被作为ECM沉积的中心事件。在细胞因子刺激之后,静止的HSCs增殖并转分化为具有促炎和促纤维化功能的纤维母细胞样细胞。而且,活化的HSCs能够分泌一系列的细胞因子和生长因子,对于维持HSCs的活化状态是有利的。在这些细胞因子中,TGF-β是肝脏中最有效的致纤维化的细胞因子,它可以刺激ECM蛋白的合成。目前大量研究证实HSCs的活化和增值大多是TGFβ依赖途径的。全长OPN (full length OPN, OPN-FL)是一种可溶性的细胞外基质蛋白,也是一种磷酸化糖蛋白。OPN蛋白包含一个经典的与细胞表面受体结合的结构域--精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸结构域(arginine-glycine-aspartic acid, RGD),这个结构域能够被细胞表面的整合素受体αvβ3,αvβ5,α4β1, and α8β1识别。这些识别RGD的整合素可表达于多种细胞表面,包括成纤维细胞、平滑肌细胞、内皮细胞、上皮细胞和免疫细胞。OPN-FL在RGD结构域外临近的氨基酸序列能够被凝血酶识别并切割。OPN-FL被凝血酶切割之后称为凝血酶切割的OPN (Thrombin-cleaved OPN, Thr-OPN),暴露出了一个新的整合素受体结合的位点--SVVYGLR序列(在小鼠中为SLAYGLR),这个位点可以被整合素α4β1和α9β1识别。肝脏纤维化可以发生在大部分类型的慢性肝脏疾病中,包括慢性乙型病毒(hepatitis B virus, HBV)感染,慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH).酒精性肝脏疾病(alcoholic liver disease, ALD)和原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC).近来的报道指出血浆OPN-FL在肝纤维化患者中升高,其升高的水平可以用于预测肝硬化的进展,并且OPN-FL能够诱导HSCs的活化。在动物模型中OPN的缺乏可以保护小鼠抵抗肝脏纤维化进展。总之,OPN参与了大部分类型慢性肝脏疾病中肝纤维化的过程。但是由于OPN可以以多种形式存在于细胞内外, 并且能够与一系列整合素受体结合发挥生物学作用,具体是哪一种形式的OPN在肝纤维化中发挥作用,以及通过哪个受体发挥作用是不清楚的。这些都是亟待解决的。Thr-OPN暴露一个新的整合素结合位点--SVVYGLR(小鼠中为SLAYGLR)序列,能够促进了表达整合素α4和α9的细胞的粘附。近来的研究表明,Thr-OPN参与了酒精诱导小鼠酒精相关性肝病模型和ConA诱导的小鼠肝炎模型中肝炎的发病机制。另外,也有研究指出Thr-OPN在心肌纤维化模型中促进了III型胶原蛋白的合成。然而,关于Thr-OPN在人类疾病中的作用研究很少,关于Thr-OPN在肝硬化中的功能亦知之甚少。因此,本文拟研究Thr-OPN在肝纤维化患者中的表达情况以及是否明显参与了肝硬化的进展。第一部分：Thr-OPN在肝纤维化患者中的表达及其对HSCs的活化和功能影响目的：明确Thr-OPN在肝纤维化患者中的表达情况,探索Thr-OPN对HSCs的活化和功能影响。方法：1)通过收集健康人,慢乙肝患者以及慢乙肝相关肝纤维化患者样本,通过ELISA方法检测其主要Thr-OPN、OPN-FL和TGF-β在肝纤维化患者中的表达情况。并分别分析Thr-OPN. OPN-FL和血浆中肝纤维化非侵入性指标(透明质酸,III型前胶原和IV胶原)以及TGF-β之间的相关性2)利用肝星状细胞株LX2细胞,并通过western blot, PCR, ELISA, MTS和微流控系统等方法研究Thr-OPN对HSCs的活化、增殖、迁移和胶原合成功能影响。结果：1)肝硬化患者血浆Thr-OPN水平明显高于慢乙肝和健康志愿者。2)肝硬化患者Thr-OPN的表达与血浆中肝纤维化非侵入性指标透明质酸,III型前胶原和IV胶原的水平均呈明显正相关,也与TGF-p水平呈明显的正相关。3) Thr-OPN能够活化HSCs,并促进其自身分泌TGF-p,有利于HSCs活化状态的维持,同时能够增强HSCs胶原生成能力,以及细胞的增殖和迁移能力。和OPN-FL相比,Thr-OPN具有更强的促进HSCs活化、胶原生成、增殖和迁移的能力。第二部分：建立CCl4诱导的小鼠肝纤维化进展模型,证实Thr-OPN参与肝纤维化的进展目的：采用CCl4诱导肝纤维化进展模型,研究Thr-OPN在小鼠肝纤维化模型的表达以及与纤维化发展之间的关系,证实Thr-OPN影响肝纤维化的进展。方法：1)建立CCl4诱导小鼠肝纤维化进展模型,首先通过Masson三色染色评估了肝纤维化程度；并通过ELISA方法检测肝脏组织中Thr-OPN和OPN-FL的表达；肝纤维化进展模型中肝组织HSCs的活化以及胶原合成的相关指标通过western blot, PCR,和免疫组化检测2)通过western blot, PCR,免疫组化,免疫荧光等方法检测肝纤维化患者和小鼠的肝脏组织中整合素受体α4和a9的表达情况。并利用肝星状细胞株LX2细胞,检测Thr-OPN刺激后肝星状细胞中整合素受体α4和α9的表达情况。结果：1)在小鼠肝纤维化进展中,Thr-OPN表达水平持续增高。2)在小鼠肝纤维化进展中,Thr-OPN的表达与肝脏纤维化程度以及肝脏中HSCs活化和胶原蛋白形成密切相关。3)肝硬化患者肝脏组织中Thr-OPN的整合素受体α4和α9的高表达,在小鼠肝纤维化进展模型中随着纤维化程度的加重,肝组织中Thr-OPN的整合素受体α4和α9的表达逐渐增加,体外实验也证实Thr-OPN活化HSCs后同时能够诱导HSCs高表达其自身受体整合素α4和α9。第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,证实Thr-OPN影响肝纤维化的进展目的：通过OPN基因敲除小鼠诱导肝纤维化模型并给予Thr-OPN切割后暴露的有效肽段,证实Thr-OPN影响肝纤维化的进展方法：体内凝血酶原的普遍存在,使体内特异性缺失Thr-OPN的状态不能够实现。因此为了研究Thr-OPN在纤维化中的作用,我们应用OPN基因敲除小鼠,完全去除各种形式的OPN的功能,然后给予小鼠OPN-FL在凝血酶切割后暴露的有效肽段(M5 peptide),通过Masson三色染色等方法检测CCl4诱导小鼠肝纤维化模型的纤维化程度。结果：1)在小鼠肝纤维化中,OPN缺乏能够减轻肝纤维化程度2)凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能够加重OPN基因敲除小鼠肝纤维化。结论：与肝炎患者和健康志愿者相比,Thr-OPN在肝硬化患者中表达明显增高,并且Thr-OPN水平与促肝纤维化因子TGF-β水平呈明显正相关。体内实验证实Thr-OPN的表达与肝脏纤维化程度以及肝脏中HSCs活化和胶原蛋白形成紧密相关。并且其整合素受体α4和α9的肝纤维化进展中高表达。与OPN-FL相比,Thr-OPN能够有效活化HSCs,促进其增殖,迁移以及胶原合成的功能,并促进HSCs高水平表达Thr-OPN整合素受体α4和α9。因此我们推测Thr-OPN通过整合素受体α4和α9参与肝纤维化进展,并在促进肝纤维化进展过程中发挥重要作用。
【关键词】：OPN Thr-OPN 肝纤维化 肝星状细胞
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 致谢6-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-17
• 缩略词表17-20
• 序言20-24
• 第一部分：Thr-OPN在肝纤维化患者中的表达及其对HSCs的活化和功能影响24-58
• 1 引言24-26
• 2 研究对象,材料和方法26-45
• 2.1 研究对象26-27
• 2.2 材料和试剂27-33
• 2.3 方法33-45
• 3 结果45-56
• 3.1 肝硬化患者血浆Thr-OPN水平明显高于慢乙肝患者和健康志愿者45-48
• 3.2 Thr-OPN的表达与血浆中肝纤维化非侵入指标的水平呈明显正相关48-50
• 3.3 血浆中Thr-OPN的表达与TGF-β水平呈明显的正相关50-51
• 3.4 Thr-OPN对HSCs的活化、增殖、迁移以及产生胶原的能力的影响51-56
• 4 讨论56-58
• 第二部分：建立CCl4诱导小鼠肝纤维化模型,证实Thr-OPN参与肝纤维化的进展58-92
• 1 引言58-59
• 2 实验材料和方法59-77
• 2.1 动物59
• 2.2 材料和试剂59-65
• 2.3 方法65-77
• 3 结果77-89
• 3.1 在小鼠肝纤维化进展过程中,Thr-OPN表达水平持续增高77-81
• 3.2 Thr-OPN的表达与肝脏中HSCs活化和胶原蛋白形成紧密相关81-84
• 3.3 Thr-OPN活化HSCs后同时能够诱导其自身受体整合素α4和α9高表达84-89
• 4 讨论89-92
• 第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,证实Thr-OPN参与肝纤维化的进展92-105
• 1 引言92-93
• 2 实验材料和方法93-100
• 2.1 动物93-94
• 2.2 肽段制备94
• 2.3 材料和试剂94-97
• 2.4 方法97-100
• 3 结果100-103
• 3.1 OPN缺乏能够减轻CCl4诱导的肝纤维化100-101
• 3.2 凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能够加重OPN基因敲除小鼠肝纤维化101-103
• 4 讨论103-105
• 参考文献105-113
• 综述113-131
• 参考文献120-131
• 作者简历131-134

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