SIRT1在小鼠肝纤维化中的作用及其相关分子的组学研究

发布时间：2017-10-04 22:28

  本文关键词：SIRT1在小鼠肝纤维化中的作用及其相关分子的组学研究

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【摘要】：目的:1.建立SIRT1肝脏特异性敲除(liver-specific knockout of SIRT1,SIRT1-LKO)小鼠模型;2.观察SIRT1-LKO及其同窝野生型(wild type,WT)小鼠在四氯化碳(carbon tetrachloride,CCL4)诱导下的肝纤维化情况;3.筛选肝纤维化中与SIRT1相关的差异分子,系统地探讨他们在肝纤维化中可能的作用;4.观察白藜芦醇(resveratrol,RES)对小鼠肝纤维化的保护作用。方法:1.利用Cre-Lox P重组酶系统构建SIRT1-LKO小鼠模型,通过琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型,实时定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)验证小鼠肝组织中SIRT1基因表达水平,Western Blot和免疫组织化学验证SIRT1蛋白表达水平。2.经腹腔注射CCL4橄榄油溶液来诱导小鼠肝纤维化,通过血清生化检测肝功能,使用Sirius red染色观察肝脏中的胶原纤维,免疫组织化学和Western Blot检测α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达来观察肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)活化。3.利用基因芯片技术和液相色谱-串联质谱(liquid chromatography tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)技术,检测SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠在CCL4和橄榄油两种不同处理因素下的基因和蛋白表达水平,依据纤维化造模结果制定筛选原则,筛选差异分子,采用DAVID Bioinformatics Resources 6.7系统进行生物信息学分析,结合蛋白质组数据库锁定候选分子并进行Q-PCR验证。4.经腹腔注射CCL4橄榄油溶液来诱导小鼠肝纤维化,同时腹腔注射白藜芦醇二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)溶液,通过血清生化检测肝功能,采用苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色观察肝组织形态,Masson三色染色观察肝脏胶原纤维。结果:1.通过对小鼠繁育、杂交和鉴定,我们成功建立了SIRT1-LKO小鼠模型,并获得了其同窝对照WT小鼠。2.造模8周后,腹腔注射20%CCL4橄榄油溶液的SIRT1-LKO小鼠和WT小鼠的血清丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate transaminase,AST)水平较单纯注射橄榄油组显著升高(P0.01),肝脏中胶原纤维增加,α-SMA蛋白表达水平升高;更为重要的是,我们首次发现同在CCL4诱导下,SIRT1-LKO小鼠较同窝WT小鼠的肝损伤和肝纤维化程度更加严重(P0.05)。3.通过对差异分子(倍数差异2)进行筛选和生物信息学分析,从m RNA转录和蛋白质表达水平发现了一组SIRT1参与肝纤维化的相关分子,并对其中8个候选分子(AFP、OIP5、CCNB2、FHL2、GPC3、POC1A、CCNB1和PHGDH)进行了Q-PCR验证,结果与基因芯片基本一致。4.造模8周后,CCL4组小鼠的血清ALT和AST水平较橄榄油组显著升高(P0.01),肝细胞出现损伤,肝脏中胶原纤维增加,而同时注射白藜芦醇DMSO溶液的小鼠肝损伤和纤维化程度明显减轻(P0.05)。结论:1.SIRT1-LKO增加CCL4诱导的小鼠肝损伤,加重肝纤维化;2.SIRT1可能与上述候选分子协同参与了肝纤维化的发生发展;3.白藜芦醇对CCL4诱导的小鼠肝损伤和肝纤维化具有明显的保护作用。
【关键词】：SIRT1 肝纤维化 生物信息学 白藜芦醇
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-14
• 文献回顾14-23
• 1 肝纤维化14-18
• 1.1 肝纤维化的形成14-16
• 1.2 肝纤维化的逆转16-17
• 1.3 肝纤维化、NAFLD与SIRT117-18
• 2 SIRT118-23
• 2.1 SIRT1的结构和分布18-19
• 2.2 SIRT1的功能19-23
• 第一部分 SIRT1-LKO小鼠模型的建立23-38
• 1 材料23-27
• 1.1 小鼠品系23
• 1.2 主要试剂及药物23-25
• 1.3 主要仪器及器材25-26
• 1.4 溶液的配制26-27
• 2 方法27-35
• 2.1 小鼠的饲养和繁殖27-28
• 2.2 小鼠基因型鉴定28-29
• 2.3 Q-PCR29-30
• 2.4 Western Blot30-33
• 2.5 免疫组织化学33-35
• 2.6 数据处理35
• 3 结果35-37
• 3.1 基因型鉴定结果35
• 3.2 Q-PCR结果35-36
• 3.3 Western Blot结果36
• 3.4 免疫组织化学结果36-37
• 4 讨论37-38
• 第二部分 SIRT1缺失加重CCL4诱导的小鼠肝纤维化38-45
• 1 材料38-40
• 1.1 小鼠品系38
• 1.2 主要试剂及药物38-39
• 1.3 主要仪器及器材39-40
• 1.4 溶液的配制40
• 2 方法40-41
• 2.1 小鼠分组40
• 2.2 肝纤维化模型的建立40
• 2.3 样本采集及送检40-41
• 3 结果41-44
• 3.1 血清学检测结果41-42
• 3.2 Sirius red染色结果42
• 3.3 免疫组织化学结果42-43
• 3.4 Western Blot结果43-44
• 4 讨论44-45
• 第三部分 筛选CCL4诱导的小鼠肝纤维化中SIRT1相关差异分子45-59
• 1 材料45-46
• 1.1 小鼠品系45
• 1.2 主要试剂及药物45
• 1.3 主要仪器及器材45-46
• 2 方法46-50
• 2.1 小鼠肝脏组织的总RNA提取46
• 2.2 基因芯片检测及差异基因筛选46-48
• 2.3 蛋白质组学分析及差异蛋白筛选48-49
• 2.4 生物信息学分析49-50
• 2.5 差异基因验证50
• 3 结果50-56
• 3.1 RNA和芯片质量检测结果50-51
• 3.2 芯片质控情况51
• 3.3 基因芯片数据筛选及生物信息学分析51-52
• 3.4 筛选候选分子52-54
• 3.5 Q-PCR验证结果54-56
• 3.6 蛋白定量结果56
• 3.7 差异蛋白筛选结果56
• 4 讨论56-59
• 第四部分 白藜芦醇减轻CCL4诱导的小鼠肝纤维化59-65
• 1 材料59-60
• 1.1 小鼠品系59
• 1.2 主要试剂及药物59
• 1.3 主要仪器及器材59-60
• 1.4 溶液的配制60
• 2 方法60-62
• 2.1 小鼠分组60-61
• 2.2 肝纤维化模型的建立61
• 2.3 样本采集及送检61-62
• 3 结果62-63
• 3.1 血清学检测结果62
• 3.2 HE染色结果62-63
• 3.3 Masson三色染色结果63
• 4 讨论63-65
• 小结65-66
• 参考文献66-76
• 附录76-86
• 个人简历和研究成果86-87
• 致谢87

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 陈立波,杨镇,裘法祖;Studies on Hepatocyte Apoptosis, Proliferation and Oncogene c-fos Expression in Carbon Tetrachloride-induced Cirrhotic Rat Liver[J];Journal of Tongji Medical University;1999年01期

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本文编号：973251