苯扎贝特对PBC患者外周血单核细胞的作用研究

发布时间：2017-10-06 08:02

  本文关键词：苯扎贝特对PBC患者外周血单核细胞的作用研究

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【摘要】：原发性胆汁性肝硬化(Primary biliary cirrhosis,PBC)是机体免疫耐受失控、自身免疫应答过高引起的肝脏自身免疫性疾病。熊去氧胆酸(Ursodeoxycholic acid, UDCA)是目前治疗PBC的一线药物,但仍有一部分患者对UDCA无应答。越来越多的临床报告显示苯扎贝特(Bezafibrate,BF)以其良好的治疗效果和较小的副作用开始走进临床PBC患者的治疗中,但其对于PBC疾病的具体作用机制尚缺乏系统的研究。固有免疫是机体防御及获得性免疫应答的基础,单核细胞作为其中主要的效应细胞,以其特有的表型特征及功能特点在PBC的发病过程中担任着重要的角色,我们前期对PBC患者外周血单核细胞的研究结果显示PBC中存在单核细胞亚群的失衡,其与肝损伤、炎症指标及Thl细胞的分化均密切相关。因此,BF能否作用于单核细胞上,从机体过度免疫应答触发的早期阻止PBC的进一步发展?目前还没有相关的研究报道。目的：观察BF对PBC患者外周血中单核细胞表型和功能的影响,及BF是否能通过调控单核细胞从而进一步影响CD4+T细胞分化,并且探讨其潜在的分子机制,为BF抗PBC的研究提供一个新的视角和实验室依据。方法：1.采集PBC患者外周血20m1,分离外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell.PBMC),进一步分选出CD14+单核细胞,以不加药处理作为对照组,其余分别加入不同浓度的BF (50μM、100μM、200μM)培养48h,RT-PCR技术检测CD16、TNF-α、IL-1β、IL-6各mRNA水平的表达,流式细胞术检测单核细胞CD16、 CD80、CD86和HLA-DR的表达频率及细胞凋亡情况。2.分离PBC患者的PBMC,从中分选出CD14+单核细胞、CD4+T细胞,将BF预处理组与未经BF处理的CD14+单核细胞分别与CD4+T细胞共培养,流式细胞术检测IFN-γ +CD4+T(Thl)细胞、IL-17+CD4+T (Th17)细胞比例及Ki-67+CD4+T细胞频率；采用Transwell细胞培养技术重复上述共培养实验,流式细胞术检测Thl细胞频率；RT-PCR检测BF作用下单核细胞中IL-12p35、IL-12p40和IL-18各mRNA的表达水平。结果：1.BF在本实验浓度范围内对PBC患者外周血中单核细胞无明显的细胞毒性(P0.05)：2.BF呈浓度依赖性抑制PBC患者单核细胞上CD16的mRNA水平和蛋白水平(P0.05),尤其在200uM的BF干预浓度下,二者的抑制率分别为44%和58%；3.BF呈浓度依赖性抑制PBC患者单核细胞促炎因子,如TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA水平(P0.01),在200μ M浓度的处理下,其抑制程度分别为49%、53%和42%：4.各浓度BF对PBC患者单核细胞共刺激分子,如CD80、CD86和HLA-DR的表达无明显影响(P0.05)；5.各浓度BF处理下,单核细胞均没有发生明显的凋亡现象(P0.05)；6.BF不能通过调控单核细胞而间接影响CD4+T细胞的增殖(P0.05)；7.BF通过调控单核细胞而间接抑制Thl细胞的分化(P0.05),但对Th17细胞分化无影响(P0.05)；8.对于Thl细胞的分化情况,无论是对照组还是BF预处理组,直接接触与间接接触的共培养方式均没有明显的差异(P0.05),两种培养方式下的BF均可通过调控单核细胞抑制Thl细胞的分化(P0.05)：9.BF抑制PBC患者单核细胞中IL-12p40和IL-18的mRNA表达水平(P0.01),而不影响IL-12p35 mRNA(P0.05)。结论：BF呈浓度依赖性抑制PBC患者外周血单核细胞CD16及促炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表达,且BF可能通过降低单核细胞分泌的可溶性分子(IL-12p40和IL-18)进一步间接抑制Thl细胞的分化。
【关键词】：苯扎贝特 原发性胆汁性肝硬化 单核细胞 CD4~+T细胞
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R575.2;R446.6
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-10
• 引言10-12
• 第一章 文献研究12-17
• 1.1 原发性胆汁性肝硬化的免疫学发病机制12-14
• 1.1.1 非特异性免疫12-13
• 1.1.2 特异性免疫13-14
• 1.2 原发性胆汁性肝硬化的治疗进展14-16
• 1.2.1 药物疗法14-15
• 1.2.2 肝移植疗法15-16
• 1.3 结语16-17
• 第二章 苯扎贝特对PBC患者外周血中单核细胞表型和功能的影响17-28
• 2.1 材料17-18
• 2.1.1 研究对象17
• 2.1.2 主要试剂17-18
• 2.1.3 主要耗材仪器18
• 2.2 实验方法18-21
• 2.2.1 药物的溶解18-19
• 2.2.2 标本的采集19
• 2.2.3 分离外周血单个核细胞19
• 2.2.4 磁珠分选CD14~+细胞19
• 2.2.5 CD14~+细胞加药培养19
• 2.2.6 CD14~+细胞总RNA的提取19-20
• 2.2.7 CD14~+细胞cDNA的合成20
• 2.2.8 引物的设计与合成20
• 2.2.9 Real-time PCR检测20-21
• 2.2.10 流式细胞术检测21
• 2.2.11 统计学分析21
• 2.3 结果21-26
• 2.3.1 BF不影响单核细胞的活性21-22
• 2.3.2 BF降低单核细胞CD16的表达22-24
• 2.3.3 BF抑制单核细胞促炎细胞因子mRNA的表达水平24-25
• 2.3.4 BF不影响单核细胞共刺激分子的表达25-26
• 2.3.5 BF不影响单核细胞的凋亡26
• 2.4 讨论26-28
• 第三章 苯扎贝特预处理的单核细胞调控CD4~+T细胞分化的研究28-38
• 3.1 材料28-30
• 3.1.1 研究对象28
• 3.1.2 主要试剂28-29
• 3.1.3 主要耗材仪器29-30
• 3.2 实验方法30-33
• 3.2.1 标本的采集30
• 3.2.2 分离PBMCs30
• 3.2.3 磁珠分选CD14~+细胞30
• 3.2.4 磁珠分选CD4~+T细胞30-31
• 3.2.5 细胞共培养31
• 3.2.6 Transwell细胞共培养31
• 3.2.7 流式细胞术检测31
• 3.2.8 CD14~+细胞总RNA的提取31-32
• 3.2.9 CD14~+细胞cDNA的合成32
• 3.2.10 引物的设计与合成32
• 3.2.11 RT-PCR检测32-33
• 3.2.12 统计学分析33
• 3.3 结果33-36
• 3.3.1 BF不能通过调控单核细胞影响CD4~+T细胞的增殖33-34
• 3.3.2 BF通过调控单核细胞间接抑制Th1细胞的分化34-35
• 3.3.3 BF通过调控单核细胞间接抑制Th1细胞分化,依赖于细胞分泌的可溶性分子35-36
• 3.3.4 BF通过调控单核细胞间接抑制Th1细胞分化,可能依赖于细胞分泌的IL-12p40和IL-18的降低36
• 3.4 讨论36-38
• 结语38-39
• 参考文献39-44
• 附录44-46
• 在校期间发表论文情况46-47
• 致谢47

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 邓日辉;陈颖;黄羽;孙静;何敏;周丹;曾星;陈曲波;;IL-1β、IL-6和IL-23对原发性胆汁性肝硬化患者Th17细胞形成的影响[J];中国免疫学杂志;2010年05期

2 陈曲波;彭桉平;黎翠翠;赵蓉;卢欣沂;何敏;周丽敏;吴炜霖;;苯扎贝特对原发性胆汁性肝硬化患者外周血CD4~+T细胞的抑制作用研究[J];中国免疫学杂志;2014年10期

中国硕士学位论文全文数据库 前1条

1 赵蓉;单核细胞在PBC中的表型特征及其对CD4~+T分化的研究[D];广州中医药大学;2014年

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本文编号：981615