骨髓间充质干细胞旁分泌物IL-10对肝星形细胞的抑制与凋亡作用研究

发布时间：2017-10-06 21:26

  本文关键词：骨髓间充质干细胞旁分泌物IL-10对肝星形细胞的抑制与凋亡作用研究

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【摘要】：肝脏疾病是一种世界性的疾病,如不能得到有效的防护和治疗,往往会进一步恶化,最终发展为肝硬化或肝癌。肝脏疾病恶化是一个漫长而又复杂的过程,在这一过程中肝脏比较明显的病理变化就是肝纤维化。肝纤维化是由肝组织过度修复再生导致的一种肝脏病理病变,在此过程中肝星形细胞(Hepatic Stellate Cells,HSCs)被激活,同时肝脏细胞外基质合成增多,降解减少,最终导致细胞外基质沉积。目前研究表明,肝纤维化是一个可逆的过程,抑制肝星形细胞的活化或者促进其凋亡可以有效逆转肝纤维化。因此,以HSCs为靶点的相关研究对肝脏疾病的治疗具有重要意义。干细胞技术是再生医学领域研究比较前言的技术之一,干细胞治疗方法也为多种疾病提供了新思路。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)因其具有取材方便、易于培养、稳定性好和毒副作用小等特点,被广泛的用于多种疾病的治疗研究,并呈现出较好的临床治疗效果。在肝脏疾病治疗方面,BMSCs也具有较好的研究基础,但是具体的机理尚不明确。骨髓间充质干细胞能分泌多种细胞因子,白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)是一种重要的抗炎症细胞因子,具有强大的抑制炎症和巨噬细胞的功能,它主要由Th2细胞分泌,有文献报道,骨髓间充质干细胞也能分泌大量的白细胞介素-10。但是,BMSCs是否通过IL-10来发挥对肝损伤的治疗作用尚不明确。所以,本课题将对这一科学问题进行探索分析。本课题采用非灌流法从大鼠体内提取肝星形细胞,通过细胞形态观察,油红O染色及苏木素染色和免疫组化对分离培养的HSCs进行鉴定。采用密度梯度离心法从大鼠股骨和胫骨分离骨髓间充质干细胞,通过细胞形态观察、免疫组化鉴定分离培养的BMSCs,通过成骨诱导和成脂诱导实验确定BMSCs的多能性。收集第3代BMSCs培养液上清,利用Elisa法检测BMSCs培养液上清中IL-10浓度,并将上清直接作用于HSCs 24h、48h和72h,分析上清对HSCs增殖和凋亡的影响。进一步通过Transwell共培养实验确定BMSCs分泌物IL-10对HSCs的影响。实验结果显示:分离培养的HSCs呈现明显的星形细胞形态,油红O染色呈阳性,并且能够表达HSCs特异性蛋白Desmin、α-SMA和GFAP。分离培养的BMSCs能够表达特异性的标记物CD29、CD44和CD45,并且具有较好的成脂和成骨分化能力。Elisa检测BMSCs培养液上清证明其具有分泌IL-10的功能,将上清直接作用于HSCs,在24h、48h和72h后均表现出对HSCs的增殖抑制效果及促进凋亡的作用。Transwell实验表明BMSCs分泌的IL-10能够有效的抑制HSCs中TGF-β1的分泌和α-SMA的表达,同时促进HSCs中凋亡蛋白caspase-3的表达。综上所述,本课题研究表明:BMSCs培养液上清具有抑制HSCs增殖并促进其凋亡的作用,进一步的研究表明上清中的IL-10对HSCs的增殖和凋亡起到关键的调控作用。因此,本实验认为BMSCs是通过IL-10实现减轻和逆转肝纤维化,为肝纤维化的临床治疗提供新的理论支持。
【关键词】：白细胞介素-10 骨髓间充质干细胞 肝星形细胞 肝纤维化
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R575
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-12
• 中英文对照12-13
• 第1章 绪论13-21
• 1.1 肝脏疾病13-15
• 1.1.1 肝损伤及其治疗13-14
• 1.1.2 肝纤维化与肝星形细胞研究进展14-15
• 1.2 干细胞与干细胞治疗15-18
• 1.2.1 骨髓间充质干细胞16-17
• 1.2.2 骨髓间充质干细胞治疗肝纤维化的途径17-18
• 1.3 白细胞介素-1018-21
• 1.3.1 白细胞介素-10 的主要功能18
• 1.3.2 白细胞介素-10 抗肝纤维化作用机制18-21
• 第2章 材料与试剂21-25
• 2.1 实验动物21
• 2.2 仪器21-22
• 2.3 试剂22-23
• 2.4 主要试剂的配方23-25
• 2.4.1 磷酸盐缓冲液（PBS）的配制23
• 2.4.2 10×TBS、1×TBST的配制23
• 2.4.3 基础培养基的配制23
• 2.4.4 成脂培养基23-24
• 2.4.5 成骨培养基24
• 2.4.6 1L 0.25%胰酶-EDTA配制24-25
• 第3章 实验方法25-32
• 3.1 BMSCs的分离培养和鉴定25-26
• 3.1.1 密度梯度离心法分离BMSCs25
• 3.1.2 BMSCs的培养25
• 3.1.3 BMSCs的鉴定25-26
• 3.1.3.1 免疫组化检测BMSCs特异性表型25-26
• 3.1.3.2 BMSCs的成骨成脂诱导分化实验26
• 3.2 HSCs的分离培养与鉴定26-28
• 3.2.1 非灌流法提取HSCs26-27
• 3.2.2 HSCs的鉴定27-28
• 3.2.2.1 免疫组化检测大鼠HSCs的特异性蛋白27-28
• 3.2.2.2 大鼠HSCs的油红O染色及苏木素染色28
• 3.3 BMSCs上清对HSCs的影响28-29
• 3.3.1 第3代BMSCs生长曲线的绘制28
• 3.3.2 第3代BMSCs培养上清的收集28
• 3.3.3 第3代BMSCs培养上清中IL-10 浓度检测28-29
• 3.3.4 BMSCs上清作用于HSCs实验29
• 3.4 BMSCs与HSCs Transwell共培养29-31
• 3.4.1 实验分组29
• 3.4.2 细胞上清收集和细胞形态观察29-30
• 3.4.3 HSCs上清中IL-10 和TGF-β1 的浓度检测30
• 3.4.4 Western blot检测HSCs中caspase-3 和α-SMA蛋白的表达30-31
• 3.4.4.1 HSCs细胞全蛋白的提取30
• 3.4.4.2 蛋白定量30
• 3.4.4.3 SDS-PAGE电泳30-31
• 3.5 数据统计31-32
• 第4章 实验结果32-46
• 4.1 BMSCs的分离培养与鉴定32-34
• 4.2 HSCs的分离培养与鉴定34-37
• 4.2.1 细胞形态学观察34
• 4.2.2 HSCs的油红O染色结果34-35
• 4.2.3 免疫组化检测HSCs特异性蛋白的表达结果35-36
• 4.2.4 HSCs第 2、5 代细胞GFAP免疫组化结果36-37
• 4.3 BMSCs上清对HSCs的作用37-40
• 4.3.1 第3代BMSCs生长曲线的绘制37-38
• 4.3.2 第3代BMSCs上清中IL-10 浓度的检测38
• 4.3.3 BMSCs上清作用后HSCs细胞形态学变化38-39
• 4.3.4 BMSCs上清作用后HSCs生长曲线的变化39-40
• 4.4 BMSCs与HSCs Transwell共培养结果40-46
• 4.4.1 HSCs的细胞形态学变化40-41
• 4.4.2 Elisa检测HSCs上清中IL-10 和TGF-β1 的浓度41-43
• 4.4.3 共培养后HSCsα-SMA和caspase-3 蛋白的表达情况43-46
• 第5章 结论46-47
• 第6章 讨论47-51
• 参考文献51-58
• 作者简介58-59
• 致谢59

【参考文献】

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本文编号：985110