以脱细胞猪角膜基质为支架体外培养人角膜上皮细胞与成纤维细胞的实验研究
本文关键词:以脱细胞猪角膜基质为支架体外培养人角膜上皮细胞与成纤维细胞的实验研究,由笔耕文化传播整理发布。
《山东大学》 2015年
以脱细胞猪角膜基质为支架体外培养人角膜上皮细胞与成纤维细胞的实验研究
张菊
【摘要】:研究背景角膜透明是维持人眼正常视觉功能的重要前提条件,但临床上各种外伤、炎症、变性等均引起角膜的混浊,造成严重的视力障碍,导致角膜盲。目前,新近不断开展的角膜屈光手术使得角膜供体材料严重不足以及移植术后的免疫排斥反应导致大多数角膜病患者得不到及时有效的角膜移植治疗。因此,利用组织工程技术三维构建人类角膜组织等替物成为近年来研究的热点,为广大角膜盲患者带来了新的希望。本实验研究体外培养获得原代人角膜上皮细胞与基质成纤维细胞,再以脱细胞的猪角膜基质(Acellular Porcine Corneal Matrix, APCM)为支架材料,探索人角膜细胞与异种脱细胞猪角膜的组织相容性,并尝试构建组织工程人角膜前板层。目的人角膜上皮细胞与角膜基质成纤维细胞体外分离培养,种植于脱细胞猪角膜基质材料,以此探讨人角膜细胞与脱细胞猪角膜基质的生物相容性,并进一步构建人角膜前板层。方法角膜手术后剩余的角膜缘环组织去除了巩膜、虹膜、结膜等组织后切成几块放入中性蛋白酶Ⅱ液中孵育1小时后,用镊子将角膜缘细胞刮除,再将获得的上皮细胞团用胰酶消化为单个细胞。去除上皮的角膜缘组织放于胶原酶Ⅰ中孵育3小时后,可见有组织块消失,大量细胞漂浮,离心后用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬放入孵箱内培养。0.5% SDS处理新鲜的猪角膜得到脱细胞猪角膜支架,H.E.染色,DAPI染色及透射电镜检测支架材料中残余细胞成分与胶原成分。培养基孵育APCM支架48小时后可得到支架浸取液,再将人角膜成纤维细胞与角膜上皮细胞分别用获得的浸取液培养,MTT方法分析角膜细胞的增殖能力。在角膜细胞接种之前将冰冻的脱细胞猪角膜支架加入培养基后放入37℃C孵育箱中孵育24小时。1ml胰岛素针将培养的第3代角膜基质成纤维细胞注入APCM材料内培养3天,将获得的第1代角膜缘上皮细胞接种于APCM支架材料的前板层表面,再共培养10天。H.E.染色,组织免疫荧光与免疫组织化学的方法用于观察构建人角膜前板层的结构。结果APCM的H.E.染色未发现残余细胞,DAPI染色未发现DNA成分。透射电镜示脱细胞猪角膜支架内未发现细胞成分,可观察到胶原成分排列整齐规则。脱细胞猪角膜支架的浸取物组对角膜上皮细胞与基质成纤维细胞的增殖能力与DMEM/F12培养基培养组相比差别分别无明显意义。H.E.染色示角膜上皮细胞接种于APCM支架表面3天后,可观察到其前表面有单层细胞样结构,5天后可见到2-3层细胞,10天后可见到3-5层细胞。角膜基质成纤维细胞注入到脱细胞猪角膜基质3天可见基质内部有散在细胞分布,注射针处较多,并可见胶原成分断裂;第5天,7天后可见支架材料内部细胞成分不断增多。构建10天的角膜前板层表面有3-5层细胞,支架内部可见散在分布的细胞,胶原有断裂的地方。构建物的组织形态与细胞表型与正常人角膜前板层的组织形态与细胞表型基本一致。H.E.染色示构建物的前表面可有3-5层细胞生长,内部有散在不均一的细胞成分。组织免疫荧光观察构建人角膜前板层表层的细胞成分高表达标志物CK12,材料内部可见表达标志物Vimentin。免疫组织化学示构建物的表层可见棕色的特异性标志物CK12表达,材料内部可见棕色的标志物Vimentin的表达。结论人角膜细胞与APCM具有很好的组织相容性,人角膜细胞能够较好的生长于APCM内,并且体外构建人角膜前板层具有可行性,为进一步的临床研究与应用奠定基础。
【关键词】:
【学位授予单位】:山东大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R772.2
【目录】:
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