甲氯灭酸在顺铂诱导的耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞损伤过程中的保护机制

发布时间：2020-11-20 16:45

　　 实验目的:顺铂是临床广泛使用的抗癌药,但也可能会带来诸多副作用,如耳毒性,多表现为感音神经性耳聋和前庭功能障碍。研究其致聋机制和筛选相应的保护药物意义重大,而且对其他一些致聋药物的治疗也有借鉴作用。RNA转录后修饰是最近几年表观遗传学研究热点之一,6-甲基腺苷(m6A)是RNA最丰富的修饰形式,由m6A甲基转移酶、m6A去甲基酶和结合蛋白三者来实施m6A水平的动态调控。业已有研究证明,RNA去甲基化酶FTO(脂肪和肥胖相关酶蛋白)的高选择抑制剂甲氯灭酸(MA)具有提高细胞内m6A水平的作用。本研究利用顺铂诱导的耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞损伤模型,探讨RNA去甲基化酶FTO的高选择抑制剂甲氯灭酸乙酯衍生物(MA2)是否对顺铂引起的毛细胞凋亡具有保护作用以及具体保护机制,以期找到新的耳毒性药物的保护药,为耳聋治疗提供新的思路。实验方法:1、首先将顺铂加入HEI-OC1细胞培养液建立毛细胞体外损伤模型,利用CCK-8检测加药后HEI-OC1细胞的相对存活率和流式细胞仪检测细胞凋亡(Annexin V-FITC/PI双染法)的方法,选择最合适的顺铂作用浓度和作用时间。接下去我们通过CCK-8确定MA2的最佳保护浓度,进而了解MA2对顺铂损伤的保护作用,再通过Westemblot分析Cleaved-Caspase3蛋白表达和流式细胞仪凋亡检测MA2对顺铂引起的HEI-OC1细胞凋亡的保护效应。结合上述实验结果确定各分组的药物作用方式:对照组(DMSO组),MA2组,顺铂组,顺铂+MA2组,后续实验均采用统一的作用方式。2、为了解细胞线粒体活性氧水平变化情况,我们用CelIROX(?)Deep Red侦查细胞内氧化应激反应,再使用流式细胞仪检测结果。为排除其他因素干扰,将H202和顺铂分入8组(对照组、顺铂组、H202组、H202+顺铂组、MA2组、顺铂+MA2组、H202+MA2组、H202+顺铂+MA2组)以多种方式作用于HEI-OC1细胞,了解相应处理后的活性氧水平变化;进一步地,我们用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况(AnnexinV-FITC/PI双染法),分析MA2对H202和顺铂引起的HEI-OC1细胞凋亡的保护作用,从而明确MA2究竟是否通过抑制活性氧产生而达到减少细胞凋亡的机制。3、我们通过透射电镜分别观察在顺铂作用HEI-OC1细胞0、24、48小时后形态变化,包括胞膜、线粒体、核仁改变以及自噬溶酶体产生等情况,以图在微观层面揭示顺铂损伤后自噬现象的发生情况。通过Westernblot分析以及免疫荧光染色等多种方式,了解自噬标志蛋白LC3-Ⅱ表达情况以及MA2是否参与了对HEI-OC1细胞顺铂损伤后自噬的调控。为进一步明确自噬在MA2对顺铂损伤后HEI-OC1细胞的保护效应中的作用,我们利用公认的自噬抑制剂LY294002和顺铂进行分组研究,通过Westemblot分析了解LC3-Ⅱ蛋白和Cleaved-Caspase3蛋白的表达情况,从而明确MA2是否通过抑制过度自噬来减少细胞凋亡。4、为进一步了解RNA表观遗传调控的作用,我们分别了解HEI-OC1细胞顺铂损伤后0、3、6、12、24、48小时后m6A的变化,以及MA2是否通过降低m6A水平来减少细胞凋亡。我们提取相应样本的总RNA,再用Dynabeads(?)mRNA纯化试剂盒提取mRNA,经安捷伦2100生物分析仪测定合格后,再通过液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)测定m6A与A的比值,从而验证MA2的FTO去甲基化酶抑制剂功能在顺铂诱导HEI-OC1细胞损伤过程中的作用是否得到发挥。实验结果:1、通过 CCK-8 分析,0 μM、5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、30 μM、40μM浓度的顺铂分别损伤HEI-OC1细胞48小时后,细胞相对存活率分别是100%、70.3 ±2.69%、56.79 ±2.97%、41.21 ±4.71%、20.72 ±3.67%、7.14 ±1.48%、5.88±1.42%。我们再选取15 μM浓度的顺铂作用HEI-OC1细胞0、3、6、12、24、48小时,通过流式细胞仪凋亡检测(AnnexinV-FITC/PI双染法),凋亡细胞比值分别为 5.29 ± 0.77%、6.55 ± 0.65%、7.85 ± 0.52%、10.13 ± 0.65%、20.1 ± 0.43%、27.47 ± 0.5%。因此,我们选择15μM顺铂作用48小时建立HEI-OC1细胞损伤模型。2、根据文献提供的浓度区间,我们选择0 μM、70μM、80μM、90μM的MA2分别作用HEI-OC1细胞48小时,CCK-8报告细胞相对存活率分别是100%、104.26 ±9.33%、95.22 ±5.67%、81.73 ±7.08%,因此我们选择 80μM 做为 MA2的工作浓度(与对照组比较无显著性差异)。为明确80μMMA2对15 μM顺铂作用HEI-OC1细胞48小时的保护效应,我们通过CCK-8检测对照组(DMSO组)、MA2组、顺铂组以及顺铂+MA2组的细胞相对存活率,分别是100%、95.13±2.20%、43.67 ± 4.74%、78.66 ± 8.89%,顺铂组和顺铂+MA2组差异肴统计学意义,提示MA2有很好的保护作用。3、Cleaved-Caspase3是蛋白酶Caspase3的活化形式,提示细胞凋亡,Westernblot分析发现在顺铂分别损伤HEI-OC1细胞0、3、6、12、24、48小时后,Cleaved-Caspase3的表达逐渐增多,在48小时达到峰值。进一步的MA2的保护研究,Western blot分析发现顺铂+MA2组相对顺铂组,Cleaved-Caspase3表达明显下降,两者差异有统计学意义,提示MA2抑制了顺铂引起的HEI-OC1细胞凋亡。流式细胞仪凋亡检测显示,顺铂组凋亡细胞比值明显上升(29.05±9.50%,对照组为4.44 ±1.68%),而顺铂+MA2组则明显下降(17.51 ±0.81%),两者差异有显著性,同样提示MA2显著减少了顺铂引起的HEI-OC1细胞凋亡。4、活性氧和耳毒性药物引起的毛细胞凋亡关系密切。通过流式细胞仪进行活性氧检测,我们发现,无论是顺铂、H202还是顺铂+H202(活性氧水平上升分别是2.16±0.07倍、2.01±0.18倍、4.73±1.21倍),MA2都可以显著降低活性氧水平(顺铂+MA2、H202+MA2、顺铂+H202+MA2 分别是 1.45±0.07 倍、1.37±0.1倍、1.77±0.16倍),前后分别比较差异均有统计学意义。同样,我们通过CCK-8检测,顺铂+MA2组的细胞相对存活率相比顺铂+H202+MA2组明显提高(80.54 ± 3.44%比59.22 ± 2.29%),通过流式细胞仪凋亡检测,顺铂+MA2组的凋亡细胞比值相比顺铂+H202+MA2组明显降低(17.56± 0.49%比24.7 ± 1.4%),差异均有统计学意义。这些结果证明MA2通过抑制了细胞内的活性氧产生而减少了顺铂引起的HEI-OC1细胞凋亡。5、自噬是细胞正常的生理现象,但过量自噬会引起细胞死亡和相应病理变化。我们通过透射电镜观察了顺铂作用0、24、48小时后HEI-OC1细胞的自噬水平的变化。正常细胞质膜完整,微绒毛清晰,线粒体形态呈椭圆形或圆形,基本未见空化,细胞核呈圆形,核内可见核仁,以常染色质为主;顺铂作用24小时以后,大部分细胞质膜尚完整,可见微绒毛,线粒体基本正常,可见少许线粒体空化,细胞浆内可见少量自噬溶酶体,细胞核异型性明显;作用48小时以后,凋亡细胞明显增多,周围可见菊花小体,细胞浆内可见大量自噬溶酶体,细胞核核质浓缩,电子密度升高,异染色质边集。LC3-Ⅱ是反映细胞内自噬体数量的经典指标,通过Westernblot分析顺铂分别损伤HEI-OC1细胞0、3、6、12、24、48小时后LC3-Ⅱ表达变化,我们发现LC3-Ⅱ表达水平逐渐上升,在48小时达到峰值。以上这些实验结果都提示顺铂损伤HEI-OC1细胞后自噬明显增多,过量自噬可能导致了细胞的凋亡。6、为了解MA2在顺铂损伤HEI-OC1细胞后自噬调控中的作用,首先实施了免疫荧光染色。我们发现顺铂组细胞的细胞质内出现了大量自噬体形成,LC3-Ⅱ强阳性表达,而在顺铂+MA2组,细胞质内出现了 LC3-Ⅱ表达下降,提示自噬体形成明显减少。其次,Westemblot分析也证实,相比顺铂组,顺铂+MA2组的LC3-Ⅱ表达明显下降。两者都提示MA2抑制了过度自噬。LY294002可以抑制PI3K/Akt信号途径,是公认的自噬抑制剂。通过Westemblot分析,我们发现不管是10μM还是20μM的LY294002,都可以抑制顺铂诱导的自噬增加表现为LC3-Ⅱ表达明显下降,同时还伴有Cleaved-caspase3表达下降。以上结果提示通过抑制自噬可以达到减少凋亡的目的,因此,MA2很可能通过参与了对顺铂引起的过量自噬的抑制,继而减少了细胞凋亡。7、我们多步骤提取的样本mRNA首先经NanoDrop浓度测定和安捷伦2100生物分析仪分析,无论是纯度还是质量都符合实验要求。我们再通过LC-MS/MS测定m6A与A的比值。我们首先发现在顺铂分别作用HEI-OC1细胞0、3、6、12、24、48小时后,细胞内的m6A水平并没有呈现有规律的变化,各时间点的m6A与A的比值差异没有统计学意义,另一方面,各处理组(对照组、MA2组、顺铂组、顺铂组+MA2组)的m6A与A的比值也没有显著性差异。以上结果提示本研究采取的顺铂损伤HEI-OC1细胞的作用方式以及MA2的保护作用没有直接与m6A表观调控相关。实验结论:甲氯灭酸通过减少细胞内活性氧积累以及抑制过度自噬产生从而减少顺铂诱导的耳蜗毛细胞系HEI-OC1细胞凋亡。甲氯灭酸对顺铂诱导的HEI-OC1细胞损伤的保护作用可能与其本身RNA去甲基化酶抑制剂的功能不直接相关。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R764.43
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本文编号：2891707