高血糖对骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的影响

发布时间：2017-04-04 16:10

  本文关键词：高血糖对骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景：年龄相关性黄斑变性（AMD）、眼组织胞浆菌病及病理性近视等眼部多种致盲性疾病，其共同病理改变为脉络膜新生血管（CNV）的生成。CNV的生成包括血管生成（angiogenesis）和血管发生（vascularization）两种形式，前者指原位血管细胞参与形成新生血管，后者则为骨髓来源细胞（BMCs）分化的血管细胞参与形成新血管的过程。炎症、缺氧和应激损伤等多种因素，均可影响CNV的发生与发展。 糖尿病是常见的慢性代谢性疾病，其持续的高血糖状态可导致全身多个组织器官损伤。在眼部，最常见的并发症是糖尿病视网膜病变（DR）。DR基本的病理变化为微血管病变，，在疾病晚期常表现为视网膜新生血管的生成。AMD是最常见的以CNV为病理特征的疾病，在新生血管形成的诱发因素及病理改变等方面，与DR有着诸多相似之处。有流行病学研究提示，糖尿病可能是AMD（尤其是新生血管性AMD）发生与发展的又一危险因素。 我组前期研究显示，高血糖加重CNV的严重程度，并可促进BMCs趋化至CNV并参与新生血管的发生。然而，由于所采用的细胞学和组织学的研究方法存在局限性，因此尚未能在造模后多个时间点实时、动态观察高血糖对BMCs参与CNV发生与发展的影响。在体生物发光成像（BLI）是一项新兴的分子影像学技术，具有无创、高灵敏度及可实时观察等优点。虽然我组已将BLI用于BMCs参与CNV发生与发展过程的动态观察，但尚未实时监测高血糖条件下BMCs是如何参与CNV的发生与发展。 目的：应用BLI、组织学及分子生物学方法，动态观察CNV造模后不同时间点高血糖对BMCs向眼部的趋化以及对CNV的影响。 方法：获取荧光素酶-绿色荧光蛋白（Fluc-GFP）双转基因小鼠的BMCs，采用尾静脉注射移植给野生型C57BL/6J小鼠构建嵌合体，嵌合度85%的小鼠纳入实验。参与实验的动物随机分为5组，即正常血糖嵌合体小鼠（Normal）组、高血糖嵌合体小鼠（DM）组、正常血糖嵌合体小鼠CNV（Normal+CNV）组、高血糖嵌合体小鼠CNV（DM+CNV）组及接受Co60照射但未行骨髓移植的野生型C57小鼠为阴性对照（Control）组。其中高血糖模型的建立，采用腹腔内链尿佐菌素（STZ，50mg/kg，连续5天）注射，血糖浓度15mmol/L者视为糖尿病模型小鼠，而正常血糖嵌合体小鼠不进行注射。另采用532nm倍频激光视网膜光凝法诱导CNV。各组模型构建成功后：（1）采用IVIS Kinetics小动物成像系统，于CNV建模后第1、3、5、7、14、21和28天，对5组小鼠的眼部发光信号进行BLI动态检测；（2）CNV造模后第7天剥取小鼠脉络膜组织并制成匀浆液，以体外荧光素酶定量测定Normal+CNV组和DM+CNV组小鼠眼部荧光强度，通过萤火虫荧光素酶活性（RLU1）、海肾荧光素酶活性（RLU2）和RLU1/RLU2（即RIOT）测定小鼠眼部CNV的BMCs数量；（3）CNV模型建立后，分别在第1、3、5、7、14、21和28天脱臼颈椎处死小鼠，制备视网膜脉络膜组织切片行HE染色，比较Normal+CNV组和DM+CNV组小鼠CNV的长度和厚度；（4）CNV建模后第7天行脉络膜铺片，比较Normal+CNV组和DM+CNV组小鼠CNV的面积；（5）CNV模型建立后第1、3、5、7、14、21和28天，收集Normal+CNV组和DM+CNV组小鼠RPE-脉络膜-巩膜复合体标本，以Western blot检测VEGF和SDF-1蛋白表达。 结果：（1）将Fluc-GFP双转基因小鼠BMCs移植给受体C57/BL6J小鼠后第28天，利用流式细胞仪检测嵌合度，纳入实验的嵌合体小鼠平均嵌合度为（88.85±2.46）%，糖尿病模型小鼠平均血糖浓度为（17.88±0.86）mmol/L，符合实验纳入标准。（2）①Normal+CNV组小鼠在BLI观察的第1天就有BMCs趋化至眼部，光学信号逐渐增强，于第7天达到峰值，随后逐渐减弱。Normal组小鼠光学信号在整个观察时像表现为平稳的波动。Normal+CNV组小鼠在建模后第1、3、5、7、14、21和28天光学信号显著高于Normal组小鼠（t=19.545、14.572、23.172、11.329、16.439、17.382和7.616，P0.05）。②DM+CNV组小鼠在BLI观察的第1天即可检测到BMCs向眼部聚集，眼部光学信号在第7天达到峰值，随后逐渐减弱。DM组小鼠光学信号从第1天到第28天表现为平稳波动，且信号强度在第1、3、5、7、14、21和28天明显低于DM+CNV组小鼠（t=15.366、11.701、17.933、23.356、16.607、13.933和11.406，P0.05）。③CNV建模后第1天，光学信号即出现于Normal+CNV组和DM+CNV组小鼠眼部，第7天信号达到峰值，且DM+CNV组明显强于Normal+CNV组，第14天后两组信号开始减弱。CNV建模后第5、7、14和21天，DM+CNV组光学信号均显著强于Normal+CNV组（t=3.869、3.551、6.142和3.021，P0.05）。（3）CNV造模后第7天，体外荧光素酶定量实验显示DM+CNV组小鼠RLU1（707.33±88.65）明显高于Normal+CNV组小鼠（255.00±52.02，t=28.88，P0.05）；DM+CNV组小鼠RIOT（1.83±0.17）明显高于Normal+CNV组小鼠（0.90±0.17，t=8.448，P0.05）。（4）小鼠视网膜脉络膜组织HE染色结果发现，CNV建模后第1、3、5、7、14、21和28天，新生血管穿过Bruch膜到达视网膜下腔。在第5、7、14和21天，DM+CNV组小鼠CNV长度显著大于Normal+CNV组（t=7.513、11.224、9.509和9.732，P0.05）。而小鼠CNV的厚度差异在DM+CNV组与Normal+CNV组无统计学意义（t=0.865、0.301、0.691、0.503、0.164、0.402和1.105，P0.05）。（5）CNV造模后第7天，DM+CNV组小鼠脉络膜铺片的CNV生成面积（32218.00±1687.16） μm2明显大于Normal+CNV组小鼠（20688.67±1488.05μm2，t=4.820，P0.05）。（6）Western blot结果提示，DM+CNV组小鼠眼部VEGF和SDF-1蛋白的表达水平明显高于Normal+CNV组小鼠（P0.05）。 结论：结合以往组织病理学结果，本研究采用BLI、组织学及分子生物学方法进一步证实：CNV在建模后第7天发展至高峰，高血糖可直接加重CNV，并可通过促使更多BMCs趋化至小鼠眼部而间接加重CNV，这些作用与局部VEGF和SDF-1蛋白表达水平相关。
【关键词】：高血糖/药物诱导 脉络膜新生血管/光凝 骨髓来源细胞 在体生物发光成像 VEGF SDF-1
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R773.4
【目录】：

• 缩略语表5-7
• 中文摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-16
• 文献回顾16-25
• 一、脉络膜新生血管16-17
• 二、糖尿病对 BMCs 的影响17-18
• 三、糖尿病与血管性疾病18-22
• 四、在体生物发光成像在眼部的应用22-23
• 五、结语23-25
• 1. 实验材料、试剂和仪器25-26
• 1.1 实验动物25
• 1.2 主要试剂25-26
• 1.3 仪器设备26
• 2. 实验方法26-32
• 2.1 获取 Fluc-GFP 双转基因小鼠 BMCs26-27
• 2.2 骨髓移植构建小鼠嵌合体模型27
• 2.3 小鼠嵌合度分析27-28
• 2.4 构建小鼠高血糖模型28
• 2.5 激光诱导小鼠 CNV 模型28
• 2.6 动物分组28-29
• 2.7 在体生物发光成像29
• 2.8 体外荧光素酶定量29-30
• 2.9 脉络膜铺片30-31
• 2.10 组织病理学分析31-32
• 2.11 VEGF 和 SDF-1 蛋白表达丰度的检测32
• 2.12 统计学分析32
• 3. 结果32-44
• 3.1 Fluc-GFP 双转基因小鼠 BMCs 形态32-33
• 3.2 小鼠平均嵌合度和平均血糖浓度33
• 3.3 高血糖促进小鼠 BMCs 参与 CNV33-39
• 3.4 高血糖增加小鼠眼部 BMCs 数量39-40
• 3.5 高血糖加重小鼠 CNV 严重程度40-43
• 3.6 高血糖影响小鼠眼部 VEGF 和 SDF-1 蛋白表达43-44
• 4. 讨论44-48
• 小结48-49
• 参考文献49-57
• 附录57-58
• 个人简历和研究成果58-59
• 致谢59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 李鹤一;王雨生;;活体光学成像技术在眼科学领域的应用前景[J];眼科新进展;2011年06期

2 常远;王雨生;曹丰;张健;蔡岩;李鹤一;侯慧媛;;在体生物发光成像术观察骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的形成[J];眼科新进展;2013年05期

  本文关键词：高血糖对骨髓来源细胞参与脉络膜新生血管的影响，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：285819