TLR7激动剂CL097对实验性自身免疫性葡萄膜炎中Th17细胞的影响

发布时间：2017-04-18 16:16

  本文关键词：TLR7激动剂CL097对实验性自身免疫性葡萄膜炎中Th17细胞的影响，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究目的人类自身免疫性葡萄膜炎是一类严重的炎症性致盲眼病,近年研究认为辅助性T淋巴细胞17(Th17)与自身免疫性疾病的发生发展密切相关,在一些自身免疫性疾病的发展过程中Toll样受体7(TLR7)可以影响Th17细胞的分化,但TLR7在实验性自身免疫性葡萄膜炎(EAU)中是否可以通过树突状细胞(DCs)调控Th17细胞的作用机制还未见报道。CL097是一种能够活化TLR7的激动剂,本研究主要探究TLR7激动剂CL097处理的小鼠骨髓树突状细胞(BMDCs)对EAU中光感受器间维生素A类结合蛋白(IRBP)1-20-特异性Th17细胞的影响,并初步探讨其可能的分子机制。方法首先通过体外重组小鼠粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rm GM-CSF)及重组小鼠白细胞介素(rm IL)-4(rm IL-4)定向诱导BMDCs,并应用流式细胞仪鉴定BMDCs。第6天向BMDCs中加入5μg/ml CL097作用8h,对照组加入等体积PBS,采用实时荧光(RT)-PCR技术检测CL097处理组与对照组BMDCs中IL-6,IL-23,IL-1β以及转化生长因子(TGF)-β(TGF-β)m RNA的相对表达量。将IRBP 1-20多肽片段与等体积含有结核杆菌素H37RA的弗氏完全佐剂(CFA)混合并充分乳化后主动免疫C57BL/6小鼠,利用间接检眼镜观察小鼠眼底炎症表现,并参照Caspi评分标准进行炎症评分。免疫后第13天取C57BL/6小鼠的眼球制作病理切片,并用苏木精-伊红染色后进行组织病理学检查。同时分离得到C57BL/6小鼠脾脏及淋巴结中IRBP1-20-特异性T细胞,并与CL097处理组及对照组BMDCs共培养至第5天,收集细胞。采用RT-PCR技术检测IL-17,γ干扰素(IFN-γ),维甲酸受体相关孤儿受体(ROR)γt(RORγt)和T盒21转录因子(T-bet)m RNA的相对表达量以及采用流式细胞仪检测Th1及Th17细胞的比率变化。将培养至第6天得到的高纯度BMDCs随机分为6组,并用CL097分别处理0h、0.25h、0.5h、1h、3h、6h,之后利用western blot检测各组BMDCs中p-p38,p-ERK1/2,p-JNK的蛋白表达量。结果1、定向诱导BMDCs的第6天,流式细胞仪鉴定结果显示BMDCs纯度可达90%。2、RT-PCR检测结果显示,BMDCs经CL097处理后IL-6、IL-23、IL-1βm RNA相对表达量较对照组显著升高(t=4.560,P=0.045;t=5.476,P=0.032;t=17.24,P=0.003),差异均有统计学意义,TGF-βm RNA相对表达量较对照组显著降低(t=10.41,P=0.009),差异有统计学意义。3、主动免疫后第13天成功建立小鼠EAU模型。4、流式细胞仪检测证实CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天,与对照组相比,Th17细胞比例由(10.240±3.173)%升至(17.750±4.793)%(t=4.938,P=0.039),差异有统计学意义(t=4.938,P=0.039)。但Th1细胞比例为(1.123±0.356)%,较对照组(1.060±0.384)%基本无变化,差异无统计学意义(t=2.714,P=0.113)。5、RT-PCR检测结果显示,CL097处理组BMDCs与IRBP1-20-特异性T细胞共培养后第5天,与对照组相比,RORγt和IL-17 m RNA的相对表达量明显升高(t=8.844,P=0.013;t=8.831,P=0.013),差异均有统计学意义,而T-bet,IFN-γm RNA相对表达量基本变化不大(t=2.078,P=0.173;t=1.082,P=0.393),差异均无统计学意义。6、western blot结果显示经CL097刺激后,BMDCs中p-p38的蛋白表达量仅在0.25h较对照组0h显著升高,之后恢复至0h水平;p-ERK1/2在0.25h、0.5h表达显著升高后又恢复至0h水平;p-JNK在0.25h、0.5h、1h表达显著升高后又恢复至0h水平。结论1、在体外,TLR7激动剂CL097能够影响BMDCs分泌与Th17细胞极化相关的细胞因子,并间接促进EAU中Th17细胞的分化。2、TLR7激动剂CL097可能是通过活化BMDCs中MAPKs(p38、ERK1/2和JNK)信号通路来间接促进EAU中Th17细胞的分化。
【关键词】：实验性自身免疫性葡萄膜炎 Toll样受体7 抗原特异性T细胞 Th17细胞 树突状细胞
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R773.9
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 缩略语/符号说明10-11
• 前言11-14
• 研究现状、成果11-13
• 研究目的、方法13-14
• 1.1 实验动物与材料14-17
• 1.1.1 实验动物14
• 1.1.2 实验主要仪器设备14-15
• 1.1.3 实验主要试剂15-17
• 1.1.4 实验主要试剂配制17
• 1.2 方法17-36
• 1.2.1 小鼠BMDCs的制备17-19
• 1.2.2 小鼠BMDCs总RNA提取19-20
• 1.2.3 测小鼠BMDCs总RNA的浓度20
• 1.2.4 小鼠BMDCs总RNA逆转录20-21
• 1.2.5 RT-PCR21-23
• 1.2.6 EAU模型的建立23-24
• 1.2.7 IRBP120特异性T细胞的制备24-25
• 1.2.8 IRBP120特异性T细胞与BMDCs共培养25-26
• 1.2.9 RT-PCR检测共培养的IRBP120特异性T细胞相关基因变化26-27
• 1.2.10 流式细胞仪检测Th17和Th1细胞的比率27-29
• 1.2.11 细胞蛋白样品的制备29-30
• 1.2.12 BCA法测定蛋白浓度30
• 1.2.13 western blot检测p-p38、p-ERK1/2以及p-JNK30-36
• 1.2.14 统计学处理36
• 1.3 结果36-42
• 1.3.1 BMDCs形态学观察与鉴定36-37
• 1.3.2 EAU模型的鉴定37-38
• 1.3.3 各组BMDCs分泌与Th17细胞极化相关基因mRNA的表达变化38-39
• 1.3.4 各组BMDCs对Th17及Th1细胞分化的影响39-40
• 1.3.5 共培养后，与Th17及Th1细胞相关基因mRNA的表达变化40-41
• 1.3.6 CL097刺激后BMDCs后p-p38、p-JNK及p-ERK1/2表达情况41-42
• 1.4 讨论42-47
• 结论47-48
• 参考文献48-53
• 发表论文和参加科研情况说明53-54
• 综述54-64
• 综述参考文献61-64
• 致谢64

【共引文献】

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1 杨敏;杨再兴;仲人前;;长链非编码RNA在免疫系统中的研究进展[J];国际检验医学杂志;2013年24期

2 李术;杨子江;;microRNA在硒对免疫调控中作用的研究进展[J];东北农业大学学报;2014年03期

3 赵明;曹莉;;表观遗传学修饰在多发性硬化症中作用的研究进展[J];第二军医大学学报;2014年07期

4 胡洋;唐洲平;;MicroRNA对间充质干细胞免疫功能的调节[J];神经损伤与功能重建;2015年02期

5 周春雷;;miR-155通过调控Smad2的表达抑制TGF-β的活性[J];黑龙江医学;2013年12期

6 孙

本文编号：315267