先天性白内障家系致病基因筛查及鉴定

发布时间：2021-05-06 17:09

　　目的:我们在中国东北地区收集到两个先天性白内障家系,家系一表现为先天性白内障伴小眼,家系二表现为先天性核性白内障。分别对两个先天性白内障家系的致病基因进行筛查,并进一步对可能的致病机制进行研究。方法:采集家系成员外周血,提取基因组DNA。对于家系一,根据白内障表型,对7个候选致病基因编码区及侧翼序列直接测序。筛查到突变位点,通过限制性片段长度多态性分析在家系和人群中验证。将野生型（WT）CRYAA和突变型（R12L）CRYAA的pcDNA3.1（+）表达载体分别转染到HEK293T细胞和Hela细胞中,用Western blot检测蛋白表达水平和蛋白溶解性,用免疫荧光检测蛋白的亚细胞定位。对于家系二,通过Miseq测序平台对4813个临床疾病相关基因进行高通量测序,筛查致病变异。对候选MAF基因突变进行PCR扩增并Sanger测序验证。基于美国遗传医学会指南和多种算法对候选致病位点致病性进行预测。REVEL,SIFT和PolyPhen2等也被用来预测突变所导致的蛋白功能改变。将野生型（WT）MAF和突变型（V271E）MAF的pcDNA3.1（+）表达载体分别与pGL3-晶状体基因启动... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：115 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
前言
第一部分：伴小眼球的先天性白内障家系(家系一)致病基因筛查及鉴定.
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验仪器
        2.2 实验中常用相关试剂及配制
            2.2.1 DNA提取
            2.2.2 酶和相关试剂
            2.2.3 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.4 DNA聚丙烯酰胺凝胶电泳
            2.2.5 载体构建相关
            2.2.6 细胞培养相关
            2.2.7 Western-blot相关试剂及缓冲液
            2.2.8 免疫荧光相关试剂、缓冲液
        2.3 方法
            2.3.1 家系资料
            2.3.2 突变筛查
            2.3.3 限制性片段长度多态性分析在家系和人群中验证突变
T,p.R12L突变致病性预测">            2.3.4 CRYAA基因c.35G>T,p.R12L突变致病性预测
            2.3.5 构建野生型CRYAA表达载体
            2.3.6 突变型CRYAA载体构建
            2.3.7 细胞培养和转染
            2.3.8 Westernblot检测蛋白水平
            2.3.9 免疫荧光检测蛋白的细胞定位
    3 研究结果
        3.1 临床资料及表型分析
        3.2 致病基因筛查
        3.3 致病基因在家系和人群验证
T,p.R12L突变致病性预测">        3.4 CRYAA基因c.35G>T,p.R12L突变致病性预测
            3.4.1 ACMG和AMP指南
            3.4.2 SIFT
            3.4.3 PlolyPhen-2
            3.4.4 CRYAA基因编码的蛋白结构和功能
        3.5 CRYAA表达载体的构建
        3.6 WT-CRYAA与R12L-CRYAA的表达水平
        3.7 WT-CRYAA与R12L-CRYAA蛋白的亚细胞定位
    4 讨论
    5 结论
第二部分：先天性核性白内障家系(家系二)致病基因筛查及鉴定
    1 前言
    2 材料和方法
        2.1 实验仪器
        2.2 实验中常用相关试剂及配制
            2.2.1 DNA提取
            2.2.2 酶和相关试剂
            2.2.3 高通量测序相关试剂
            2.2.4 琼脂糖凝胶电泳
            2.2.5 载体构建相关
            2.2.6 细胞培养相关
            2.2.7 荧光素酶报告基因检测
        2.3 方法
            2.3.1 家系资料
            2.3.2 突变筛查
            2.3.3 变异的致病性预测
            2.3.4 表达载体的构建
            2.3.5 细胞培养和转染
            2.3.6 荧光素酶报告基因检测
    3 研究结果
        3.1 临床资料及表型分析
        3.2 致病基因筛查及验证
A,p.V217E突变致病性预测">        3.3 MAF基因c.812T>A,p.V217E突变致病性预测
            3.3.1 ACMG和AMP指南
            3.3.2 SIFT
            3.3.3 PlolyPhen-2
            3.3.4 MAF基因编码的蛋白结构和功能
            3.3.5 MAF基因编码的蛋白结构和功能
        3.4 MAF表达载体的构建
A,p.V271E对转录因子活性的影响">        3.5 突变MAFc.812T>A,p.V271E对转录因子活性的影响
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性及局限性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的科研成果
致谢
个人简介


【参考文献】：
期刊论文
[1]一个新的GJA8突变导致一家系遗传性白内障[J]. 肖伟,张天晓,张劲松.  眼科新进展. 2011(04)

博士论文
[1]先天性核性白内障家系的疾病相关候选基因定位及功能研究[D]. 王琦玮.浙江大学 2015

硕士论文
[1]PAX6基因突变所致的先天无虹膜伴进展性白内障一个中国家系研究[D]. 王琦玮.浙江大学 2012



本文编号：3172305