NOR1是调节肿瘤细胞自噬/凋亡分子开关的氧化应激反应性蛋白

发布时间：2021-05-28 08:48

　　本课题前期研究工作基础NOR1是本实验室自主克隆的鼻咽癌易感基因,在鼻咽癌组织中显著下调,但其下调机制和转录调控规律尚未阐明。NOR1蛋白定位于线粒体和胞浆中,与OSCP蛋白存在直接交互作用；NOR1表达抑制鼻咽癌细胞的生长与增殖,并促进缺氧引起的细胞凋亡。但该基因在肿瘤发生发展中的作用及机制研究的还未成熟。定位克隆NOR1基因的核心启动子采用预测软件PromoterScan、PromoterInspector和EMBOSS CpG Plot综合分析发现,NOR1基因启动子区可能位于转录起始位点（为+1）上游-517bp至下游+236bp以内。为了确定NOR1基因核心启动子序列,将NOR1基因的预测启动子调控区分为几段,构建出一系列NOR1基因不同调控区荧光素酶报告载体和绿色荧光蛋白报告载体。通过luciferase assay和荧光显微镜观察联合分析,发现NOR1核心启动子定位于NOR1基因5’端-258/+26区间内。NOR1基因启动子区存在一个典型的CpG岛,在鼻咽癌组织和细胞中因启动子高甲基化修饰而表达下调MatInspector软件分析发现NOR1基因启动子区序列无TATA盒... 

【文章来源】：中南大学湖南省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：129 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
主要縮略词简表
1 前言
2 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 细胞系和组织样本
        2.1.2 菌株和质粒载体
        2.1.3 试剂
        2.1.4 主要仪器
    2.2 方法
        2.2.1 生物信息学分析
        2.2.2 基因组DNA的提取
        2.2.3 胶回收(按试剂盒说明书步骤进行)
        2.2.4 转化反应
        2.2.5 载体的构建
        2.2.6 质粒、siRNA转染目的细胞
        2.2.7 慢病毒转染目的细胞
        2.2.8 核心启动子检测
        2.2.9 甲基转移酶SssⅠ处理DNA
        2.2.10 凝胶迁移率实验(EMSA)
        2.2.11 染色质免疫共沉淀实验ChIP检测
        2.2.12 基因组DNA的亚硫酸氢钠修饰
        2.2.13 亚硫酸氢钠测序法(Bisulfite Genomic Sequencing,BGS)
        2.2.14 甲基化特异性PCR(Methylated specific PCR,MSP)
        2.2.15 组织及细胞RNA制备及cDNA的转录
        2.2.16 差异RT-PCR
        2.2.17 细胞蛋白制备
        2.2.18 Western blot检测
        2.2.19 免疫荧光实验
        2.2.20 流式细胞术检测基因蛋白表达水平
        2.2.21 肿瘤细胞生长实验
        2.2.22 软琼脂集落生成实验
        2.2.23 MTT法检测细胞活力
        2.2.24 MTT法检测药物对细胞毒性的IC50
        2.2.25 LDH法测量细胞毒性
        2.2.26 TUNEL技术检测细胞凋亡
        2.2.27 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡
        2.2.28 乳酸生成实验
        2.2.29 耗氧量检测
        2.2.30 ROS检测
        2.2.31 统计学分析
3 结果
    3.1 NOR1的转录调控规律及氧化应激敏感性表达
        3.1.1 NOR1基因启动子的定位及克隆
        3.1.2 NOR1基因在鼻咽癌中甲基化沉默
        3.1.3 NOR1基因启动子区域的转录调控机制及氧化应激敏感性表达
    3.2 NOR1对鼻咽癌生物学行为的影响
        3.2.1 NOR1基因抑制恶性肿瘤细胞生长和增殖
        3.2.2 NOR1基因抑制恶性肿瘤细胞自噬分子表达和自噬行为
        3.2.3 NOR1表达抑制肿瘤细胞的能量代谢
    3.3 NOR1基因对氧化应激状态下细胞自噬/凋亡分子开关的调节
        3.3.1 NOR1增加氧化应激状态下细胞毒性,降低细胞活力
        3.3.2 NOR1通过抑制氧化应激诱导的细胞自噬,促进细胞凋亡
        3.3.3 NOR1增加化肿瘤细胞的化疗敏感性
4 讨论
    4.1 抑癌基因NOR1是一个在鼻咽癌中甲基化沉默的氧化应激反应性蛋白
        4.1.1 抑癌基因NOR1启动子在鼻咽癌中甲基化沉默
        4.1.2 抑癌基因NOR1是一个氧化应激反应性蛋白,功能与氧化应激相关
    4.2 抑癌基因NOR1的生物学功能
        4.2.1 抑癌基因NOR1同时抑制肿瘤生长和自噬
        4.2.2 抑癌基因NOR1通过抑制自噬来抑制肿瘤细胞能量代谢,发挥抑癌的作用
    4.3 抑癌基因NOR1通过抑制细胞自噬,促进氧化应激诱导的肿瘤细胞凋亡
    4.4 抑癌基因NOR1通过线粒体凋亡途径促进氧化应激诱导的肿瘤细胞凋亡
    4.5 抑癌基因NOR1与顺铂协同抑制自噬,增强鼻咽癌细胞对顺铂的化疗敏感性
结论
参考文献
综述
    参考文献
攻读博士学位期间主要研究成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]顺铂诱导的自噬在口腔鳞癌Tca83细胞中的作用[J]. 白宇,全海英,张桐菲,赵轩一,张泽兵.  口腔医学研究. 2012(06)
[2]细胞自噬的研究方法[J]. 马泰,孙国平,李家斌.  生物化学与生物物理进展. 2012(03)
[3]细胞自噬在肿瘤发生发展中的作用[J]. 向波,易梅,李小玲,李桂源.  生物化学与生物物理进展. 2012(03)
[4]抑制Beclin 1促进H2O2诱导的神经胶质瘤U251细胞凋亡[J]. 孔晓霞,张宏宇,陈兆琴,范小芳,龚永生.  生理学报. 2011(03)
[5]细胞自噬与肿瘤[J]. 杜海磊,邱伟华,杨卫平.  中国病理生理杂志. 2010(02)
[6]细胞自噬在肿瘤中作用的研究进展[J]. 李国东,吴德全,李本义.  癌症. 2009(04)
[7]自噬在细胞存活和死亡中的作用[J]. 何韬,王海杰,谭玉珍.  生理科学进展. 2008(01)
[8]鼻咽癌的危险因素[J]. 尚学兰,谢志强,黄志碧.  现代预防医学. 2008(02)
[9]中国西南地区汉族人群肿瘤坏死因子基因多态性与鼻咽癌遗传易感性[J]. 张蓓蕾,梁伟波,冉鹏,周斌,韦叶生,张更谦,王晶,张林.  中国组织工程研究与临床康复. 2007(34)
[10]EB病毒与鼻咽癌相关免疫学的研究进展[J]. 杨贵.  宜春学院学报. 2007(02)



本文编号：3207948