壳聚糖衍生物对蒸发过强型大鼠干眼症缓解作用的研究

发布时间：2017-05-21 16:02

  本文关键词：壳聚糖衍生物对蒸发过强型大鼠干眼症缓解作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：实验目的： 随着计算机的普遍应用，使用者眼睛长期受电磁辐射和强光刺激，瞬目率减少，引起泪膜不稳定，造成眼表损害，引发眼睛干涩、发痒、红肿等干眼症状。目前干眼症最基本的治疗方法是使用人工泪液。近年来人工泪液从增加水分润湿眼表治疗轻度干眼症，逐渐向修复受损眼表细胞治疗中重度干眼症的方向发展。 壳聚糖具有良好的生物相容性、可生物降解且降解产物无毒，是理想的生物医用材料。壳聚糖及其衍生物在眼科方面的研究表明，其可以促进受损角膜上皮的愈合，促进结膜上皮细胞生长，可作为角膜上皮细胞、基质细胞和内皮细胞的组织工程材料，在眼表疾病治疗方面具有广泛的应用前景。本实验主要以高分子量壳聚糖化学制备的羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖为材料，制作蒸发过强型大鼠干眼症模型，并评价这两种材料对缓解该类干眼症状的作用效果。实验方法：1.化学合成法制备出羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖，并对其进行基团取代位置、取代度、分子量等理化性质的表征。2.在室内温度为22oC、空气相对湿度为20%的环境中，通过缝合大鼠的上下眼睑暴露角结膜6天来制作动物干眼症模型，并通过Schirmer I试验、泪膜破裂时间检测、荧光素钠染色以及病理组织切片来评价该模型建立效果。3.评价羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖对造模成功的大鼠干眼症的缓解作用。以无菌泪液缓冲液为阴性对照、市售玻璃酸钠为阳性对照，将羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖配成具有一定pH值和渗透压的水溶液，对模型组大鼠每天滴眼3次，分别于滴眼后2天、4天、7天、14天对各组大鼠进行眼表检查，泪液分泌量检测、荧光素钠染色观察、泪膜破裂时间检测、组织病理学切片检查等。4.体外大鼠眼结膜杯状细胞的原代培养。无菌环境下完整取下大鼠眼球，剪取结膜组织部分，置于含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液中，以组织块培养法进行培养。显微镜下观察迁出细胞形态，并通过免疫荧光染色鉴定结膜杯状细胞的迁出生长情况。 实验结果： 1、对羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的基本理化性质的测定结果显示羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的取代位均主要在C6位的羟基上，羧基取代度为0.98，羟乙基取代度为3.11，分子量分别为196kD和124kD。 2、通过缝合大鼠的上下眼睑暴露角结膜的干眼症模型组动物，其泪液分泌量相对于正常组动物明显下降，泪膜破裂时间缩短、角膜上皮细胞部分缺失。眼球组织切片可见模型组动物的眼球结膜、穹窿部结膜和睑结膜中杯状细胞数量急剧降低。上述结论说明大鼠干眼模型制作成功，并为后面研究壳聚糖衍生物对干眼症的缓解作用奠定了基础。 3、本研究配制的羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖两种滴眼液的pH值分别为7.31和7.39，渗透压分别为319mOsm/kg和317mOsm/kg，均符合眼部用药的基本要求。随着滴眼液滴眼时间的增加，泪液缓冲液阴性组大鼠的各项眼表泪液指标均较模型组的变化不明显，角膜损伤至第14天仍为阳性，泪液分泌量虽有所增加但只恢复至正常组的约40%。玻璃酸钠组大鼠的角膜损伤至第14天已完全恢复，其泪液分泌量自第4天起明显增加，至第7天已恢复至正常大鼠的85%，其后变化不大；羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖改善大鼠干眼症状的效果与玻璃酸钠类似。眼表组织病理切片HE染色、AB-PAS、MUC5AC免疫荧光染色结果表明玻璃酸钠、羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖均可促进角膜细胞的修复，随着滴眼时间的延长，大鼠眼球结膜、穹窿部结膜和睑结膜的杯状细胞的含量也大幅增加。这些结果表明羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖均能缓解大鼠蒸发过强型干眼症的症状，同时暗示这些物质可以通过促进结膜杯状细胞修复来发挥作用的。 4、大鼠结膜杯状细胞的原代培养，培养第2天贴壁组织块边缘会长出少量细胞，到第4天细胞逐渐增多，细胞呈现多角形或梭形，第5天往后变化不明显，有悬浮的死细胞出现。原代培养第2天到第7天对迁出细胞进行免疫荧光鉴定，结果表明该时间段内杯状细胞的生长呈现先上升然后下降的趋势。结论：羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖对大鼠蒸发过强型干眼症起到了缓解作用，为治疗VDT干眼症的医学材料研究提供了实验依据。
【关键词】：干眼 羧甲基壳聚糖 羟乙基壳聚糖 结膜杯状细胞
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R777.34
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-16
• 第一章 前言16-26
• 1.1 干眼症的类型17
• 1.2 干眼症的发病机制17-20
• 1.2.1 泪膜的稳定性17-18
• 1.2.2 泪液动力学18
• 1.2.3 炎症18-19
• 1.2.4 神经调控异常19-20
• 1.2.5 细胞凋亡20
• 1.2.6 性激素失调20
• 1.3 干眼症动物模型的建立20-23
• 1.3.1 蒸发过强型干眼模型21
• 1.3.2 泪液缺乏型干眼模型21
• 1.3.3 实验诱发干眼模型21-22
• 1.3.4 苯扎氯铵诱发干眼模型22
• 1.3.5 肉毒杆菌毒素 B 诱发干眼模型22
• 1.3.6 泪液高渗透压性干眼模型22
• 1.3.7 神经调控干眼模型22
• 1.3.8 性激素失调干眼模型22-23
• 1.4 干眼症的治疗23
• 1.5 壳聚糖及其衍生物在眼科方面的应用23-25
• 1.6 本论文的研究目的及意义25-26
• 第二章 羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的制备及表征26-35
• 2.1 材料、试剂与仪器26-28
• 2.1.1 实验材料26-27
• 2.1.2 实验试剂27
• 2.1.3 主要实验仪器27-28
• 2.2 实验方法28-32
• 2.2.1 材料的制备与纯化28-29
• 2.2.1.1 羧甲基壳聚糖的制备方法28
• 2.2.1.2 羟乙基壳聚糖的制备方法28
• 2.2.1.3 材料的纯化方法28-29
• 2.2.2 材料性质的测定29-31
• 2.2.2.1 水分的测定29
• 2.2.2.2 灰分的测定29-30
• 2.2.2.3 pH 的测定30
• 2.2.2.4 相对分子量的测定30
• 2.2.2.5 脱乙酰度的测定30-31
• 2.2.2.6 羧甲基壳聚糖羧基取代度的测定31
• 2.2.2.7 羟乙基壳聚糖羟基取代度的测定一元素分析法31
• 2.2.3 FTIR 表征31-32
• 2.3 结果与讨论32-34
• 2.3.1 羧甲基壳聚糖和羟乙基壳聚糖的理化性质32
• 2.3.2 FTIR 表征32-34
• 2.4 本章小结34-35
• 第三章 干眼症动物模型的建立35-51
• 3.1 实验动物及饲养35-36
• 3.1.1 实验动物35
• 3.1.2 饲养环境35-36
• 3.2 实验仪器与试剂36-37
• 3.2.1 主要实验仪器36
• 3.2.2 实验试剂与器械36-37
• 3.2.2.1 实验试剂36-37
• 3.2.2.2 实验器械37
• 3.3 干眼模型的建立方法37-38
• 3.4 评价指标及其测试方法38-42
• 3.4.1 观察大鼠眼表变化情况38
• 3.4.2 Schirmer I 试验38
• 3.4.3 泪膜破裂时间的测定38-39
• 3.4.4 荧光素染色39
• 3.4.5 病理组织切片观察39-42
• 3.4.5.1 眼球石蜡切片制作39-40
• 3.4.5.2 石蜡切片 HE 染色40-41
• 3.4.5.3 石蜡切片 AB-PAS 染色41
• 3.4.5.4 眼球冰冻切片制作及观察41-42
• 3.5 实验结果42-49
• 3.5.1 眼表观察及荧光素钠染色42-43
• 3.5.2 Schirmer I 试验43-44
• 3.5.3 泪膜破裂时间（BUT）44
• 3.5.4 组织切片观察44-49
• 3.5.4.1 角膜组织石蜡切片 HE 染色44-45
• 3.5.4.2 结膜组织石蜡切片 HE 染色45-47
• 3.5.4.3 眼球石蜡切片 AB-PAS 染色47-48
• 3.5.4.4 眼球冰冻切片免疫组化染色48-49
• 3.6 讨论49-50
• 3.7 本章小结50-51
• 第四章 壳聚糖衍生物对大鼠干眼症的作用评价51-69
• 4.1 实验材料与方法51-53
• 4.1.1 实验材料51
• 4.1.2 实验试剂51-52
• 4.1.3 实验器械52
• 4.1.4 主要实验仪器52-53
• 4.2 滴眼液的制备及理化性质测定53-54
• 4.2.1 滴眼液的配制53-54
• 4.2.2 理化性质的测定54
• 4.2.2.1 pH 的测定54
• 4.2.2.2 渗透压的测定54
• 4.3 眼部给药54
• 4.4 滴眼后的观察54
• 4.5 实验结果54-67
• 4.5.1 各种滴眼液的理化性质54-55
• 4.5.2 眼表观察及荧光素钠染色55-56
• 4.5.3 Schirmer I 试验56-57
• 4.5.4 泪膜破裂时间57
• 4.5.5 眼球石蜡切片 HE 染色57-62
• 4.5.5.1 角膜组织石蜡切片 HE 染色57-58
• 4.5.5.2 结膜组织石蜡切片 HE 染色58-62
• 4.5.6 眼球石蜡切片 AB-PAS 染色62-65
• 4.5.7 眼球冰冻切片免疫组化染色65-67
• 4.6 讨论67-68
• 4.7 本章小结68-69
• 第五章 大鼠眼结膜杯状细胞原代培养的初步探究69-75
• 5.1 实验试剂及器材69-70
• 5.2 实验仪器70
• 5.3 大鼠眼结膜杯状细胞原代培养70-71
• 5.4 细胞的免疫荧光鉴定71
• 5.5 实验结果71-73
• 5.5.1 大鼠结膜杯状细胞的原代培养71-72
• 5.5.2 细胞的免疫荧光鉴定72-73
• 5.6 讨论73-74
• 5.7 本章小结74-75
• 全文总结75-77
• 参考文献77-86
• 论文的创新点与不足86-87
• 致谢87
• 个人简历87
• 发表的学术论文87-88

【参考文献】

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本文编号：384107