新生血管特异性结合肽GX1抑制糖尿病视网膜病变新生血管生成的实验研究

发布时间：2017-06-16 15:09

  本文关键词：新生血管特异性结合肽GX1抑制糖尿病视网膜病变新生血管生成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【背景】 糖尿病视网膜病变(Diabetic retinopathy, DR)是最为常见的糖尿病微血管并发症之一，为成人致盲四大原因之一，严重威胁人类健康，其病理改变主要以视网膜新生血管生成为主，且伴有渗出、出血等病变，最终导致眼结构和功能的严重破坏，视网膜脱离，甚至造成失明。因此，抑制视网膜新生血管生成对治疗糖尿病视网膜病变有重要意义。传统的玻璃体切除术、全视网膜激光光凝等疗法，风险大、费用高、疗效有限，治疗后易复发，并有一定的视功能损害。目前，肿瘤治疗领域出现的分子靶向治疗为糖尿病视网膜病变新生血管生成的治疗提供了新思路，采用这种治疗策略在提高抑制糖尿病视网膜病变新生血管治疗疗效的同时，可降低药物的毒副作用，而寻找视网膜新生血管特异表达的分子成为其关键环节。 最新研究报道，肿瘤血管所表达的某些特异性分子，如aminopetidases及整合素受体在糖尿病视网膜病变中也有表达，并可介导噬菌体靶向及内化入内皮细胞。靶向αⅤβ3/αⅤβ5的小肽RGD-4C可通过选择性激活视网膜内皮细胞凋亡而抑制氧诱导的视网膜新生血管生成，说明视网膜新生血管与肿瘤血管有某些体内所共同表达的分子，这些分子有望成为糖尿病视网膜病变抗新生血管生成的新靶点。 我们利用体内噬菌体呈现肽技术得到的GX1，是一种与人胃癌血管内皮细胞特异性结合的环九肽CGNSNPKSC，已获国家专利。体外实验显示，GX1能抑制人脐静脉内皮细胞（HUVEC）、与人胃癌细胞SGC7901共培养的HUVEC（Co-HUVEC）的增殖、管状结构形成等，体内抑制鸡胚尿囊膜新生血管生成，GX1与rmhTNFα的融合蛋白GX1-rmhTNFα可明显抑制荷胃癌小鼠肿瘤组织的生长，说明GX1可能具有抗肿瘤血管生成的作用。进一步研究发现，GX1能够与氧诱导小鼠视网膜新生血管特异性结合，提示其受体可能在视网膜新生血管生成中发挥重要功能，是视网膜新生血管的特征性分子，因此有必要进一步明确GX1及其受体在视网膜新生血管生成中的功能，本研究就将围绕以上问题展开。 【目的】 1.验证GX1短肽与糖尿病视网膜病变新生血管内皮细胞的结合特异性。 2.体外实验探讨GX1对糖尿病视网膜病变新生血管内皮细胞增殖、迁移、微管形成、周期及凋亡等生物学特性的影响，为体内试验提供依据。 3.体内实验探讨GX1对高氧诱导小鼠视网膜新生血管生成的干预效果，从而阐明GX1对糖尿病视网膜病变新生血管生成的生物学功能。 【方法】 1.利用化学合成的GX1短肽、对照肽（CNKSPSGNC, Pep2）及与生物素结合的GX1（bio-GX1）、Pep2（bio-Pep2）采用免疫细胞化学及免疫细胞荧光的方法检测大鼠视网膜微血管内皮细胞（rat retinal microvascularendothelial cells, rRMECs）有无GX1受体特异性表达，以鉴定GX1对糖尿病视网膜病变视网膜新生血管内皮细胞的靶向能力。 2.通过MTT实验、管状结构形成实验、迁移实验研究GX1对rRMECs增殖能力、微管形成能力、迁移能力等生物学特性的影响。 3. GX1对rRMECs作用后，经流式细胞学技术分析其细胞周期分布和凋亡情况，为GX1作用的机制研究提供参考。 4.构建高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型，通过视网膜组织切片计数GX1、Pep2及PBS腹腔注射后视网膜突破内界膜的内皮细胞核数目及视网膜铺片，，对高氧诱导视网膜新生血管生成的干预效果进行评价，从而阐明GX1对糖尿病视网膜病变新生血管生成的生物学功能。 【结果】 1.免疫细胞化学染色及免疫细胞荧光检测证实，与Pep2和PBS相比，GX1短肽可与rRMECs特异性结合，验证了GX1对糖尿病视网膜病变视网膜新生血管的靶向结合能力。 2. MTT实验、管状结构形成实验、迁移实验结果显示，GX1可以抑制rRMECs的增殖，且其抑制作用呈剂量依赖性；同时GX1可抑制rRMECs的微管形成、迁移能力；此外，GX1可部分抑制血管内皮细胞生长因子165（VEGF165）诱导的rRMECs的增殖、微管形成及迁移增加。 3.流式细胞学分析显示，与Pep2相比，GX1可显著诱导rRMECs的凋亡（凋亡率分别为5.33%和7.33%）（P0.05）；而GX1对细胞周期分布则无明显影响。 4.成功构建了高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型，在眼球组织切片上计数突破视网膜内界膜的视网膜新生血管内皮细胞核数可以看出，与腹腔注射Pep2组、PBS组及未注射GX1组相比，腹腔注射GX1组细胞核数明显降低。视网膜铺片中，可见腹腔注射GX1组视网膜新生血管的密度和异常程度明显轻于腹腔注射Pep2组、PBS组及未注射GX1组。正常对照组未见明显异常。 【结论】 1.GX1短肽具有糖尿病视网膜病变新生血管靶向性，并能抑制糖尿病视网膜病变新生血管内皮细胞的增殖、微管形成及迁移，以及诱导其凋亡，在体外发挥抗糖尿病视网膜病变新生血管生成的作用。 2.GX1可抑制高氧诱导小鼠视网膜新生血管模型中的视网膜新生血管形成，从而为临床上治疗糖尿病视网膜病变视网膜新生血管生成提供新的思路。
【关键词】：糖尿病视网膜病变 血管生成 血管靶向 噬菌体展示肽
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R774.1
【目录】：

• 缩略语表6-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 前言18-20
• 文献回顾20-30
• 1 血管生成与糖尿病视网膜病变20-25
• 1.1 血管生成20-21
• 1.2 视网膜新生血管的生成21
• 1.3 糖尿病视网膜病变的病理改变21-22
• 1.4 糖尿病视网膜病变新生血管生成的机制22-24
• 1.5 糖尿病视网膜病变的防治进展24-25
• 2 糖尿病视网膜病变与血管抑制分子靶向治疗25-26
• 2.1 分子靶向治疗25
• 2.2 血管抑制分子靶向治疗25
• 2.3 糖尿病视网膜病变血管抑制分子靶向治疗25-26
• 3 GX1 的背景26-28
• 3.1 GX1 的体内筛选26
• 3.2 GX1 胃癌血管内皮结合靶向性的鉴定26-27
• 3.3 GX1 抗肿瘤作用的研究27-28
• 3.4 GX1 受体的筛选28
• 4 GX1 受体在氧诱导视网膜新生血管上的表达28-30
• 实验一 GX1 短肽对大鼠视网膜微血管内皮细胞靶向性的鉴定30-39
• 1 材料30-31
• 2 方法31-34
• 3 结果34-37
• 4 讨论37-39
• 实验二 GX1 对体外培养大鼠视网膜微血管内皮细胞血管生成功能的影响39-51
• 1 材料39
• 2 方法39-42
• 3 结果42-48
• 4 讨论48-51
• 实验三 GX1 短肽抑制小鼠视网膜新生血管生成51-59
• 1 材料51
• 2 方法51-53
• 3 结果53-56
• 4 讨论56-59
• 小结59-60
• 参考文献60-69
• 个人简历和研究成果69-70
• 致谢70

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘X;许迅;;糖尿病性视网膜病变眼科治疗的新进展[J];上海医学;2009年05期

2 韩宇;洪流;吴开春;曹姗姗;贺莉;樊代明;;环行七肽CGNSNPKSC的受体鉴定及其在胃癌中的表达[J];现代肿瘤医学;2007年04期

3 贺莉;吴开春;惠晓莉;陈瑜;梁树辉;陈蓓;曹姗姗;闫X;韩宇;姚芳芳;杨利萍;韩英;樊代明;;应用免疫沉淀-质谱法筛选肿瘤血管靶向肽CGNSNPKSC的结合受体[J];现代肿瘤医学;2008年08期

  本文关键词：新生血管特异性结合肽GX1抑制糖尿病视网膜病变新生血管生成的实验研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：455717