鼻咽癌HOX基因表达谱及其转录调控机制的研究

发布时间：2017-07-27 15:29

  本文关键词：鼻咽癌HOX基因表达谱及其转录调控机制的研究

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【摘要】：同源异型基因HOX基因(Homeotic genes)属于同源异形盒(Homeobox)家族一员,是一类进化高度保守的转录因子。HOX基因通过在转录水平调控发育相关基因,控制组织和器官的形成。目前研究表明HOX基因表达异常会导致胚胎发育异常,某些重大疾病如恶性肿瘤的发生发展也与HOX基因表达谱异常密切相关。 鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma, NPC)是一种在世界上大部分地区罕见但在中国南部以及东南亚地区高发的恶性肿瘤,其主要的致病因素EB病毒(Epstein-Barr Virus, EBV)编码的潜伏膜蛋白1(Latent Membrane Protein1, LMP1)是目前已被确证具有瘤基因功能的蛋白。我们以鼻咽癌细胞为模型,通过基因芯片和RT-PCR方法在细胞水平检测了HOX基因表达谱,LMP1阳性鼻咽癌细胞系与阴性细胞系相比,部分HOX基因如HOXA5, HOXB3, HOXB13, HOXC8等比阴性细胞系异常低表达。随后,我们又在23例鼻咽癌组织样本中通过免疫组化方法在组织水平发现LMP1阳性组织中这些HOX基因同样发生低表达趋势,与细胞水平结果一致。我们进一步采用报告基因分析法,证明了EBV LMP1可显著抑制HOXB13和HOXC8启动子活性,并呈剂量依赖效应。这些研究发现提示HOX基因可能为一类受EBVLMP1负性调节的靶基因。 HOX基因表达调控涉及多方面,转录调控是最为直接有效的方式之一。真核生物基因通过RNA聚合酶Ⅱ(RNA Polymerase Ⅱ, Pol Ⅱ)的转录产生mRNA。新近研究表明,在人类基因组中50%的基因处于转录活化状态,20%的基因处于沉默状态(无Pol Ⅱ结合),其余的基因同样处于沉默状态,但近端启动子区域却有结合Pol Ⅱ即处于Pol Ⅱ Stalling状态。采用ChIP法,我们通过检测了HOXA5, HOXB3, HOXB13和HOXC8等基因的转录起始位点(transcriptionstart site, TSS)区域Pol II富集程度,结果发现LMP1阳性鼻咽癌细胞系中HOX基因的TSS区域同样有Pol Ⅱ的富集,表明这些HOX基因为Stalled基因,提示EBV LMP1可通过Pol II Stalling的转录调控方式调控HOX基因。 放射治疗为目前鼻咽癌的主要治疗方式。放射处理可诱发DNA损伤修复(DNA Damage Response, DDR),令人感兴趣的是,DDR可诱发一些靶基因发生DNA去甲基化。新近报道,5hmC直接参与DNA去甲基化过程,而DNA去甲基化与基因重新活化相关。我们首先通过放射处理CNE1-LMP1细胞建立DNA损伤修复模型,在此基础上,我们进一步发现放射处理可使LMP1失活的HOXA5,HOXB3, HOXB13和HOXC8等基因重新活化,其机制与这些HOX基因TSS区的Stalled Pol Ⅱ重新释放和5mC及5hmC甲基化水平降低等有关,并伴随DNA去甲基化酶TET2表达水平增高。这些研究提示TET2和5hmC有可能参与DNA去甲基化,从而释放Stalled Pol Ⅱ,导致HOX基因的重新活化。 我们通过生物信息学分析发现在60种肿瘤细胞系(http://discover.nci.nih.gov/cellminer/analysis.do)中HOXA5,HOXB3, HOXB13, HOXC8与多种能量代谢基因具有显著相关性,这提示我们HOX基因可能作为转录因子对肿瘤能量代谢具有重要作用,其中HOXC8与能量代谢相关基因最为密切。因此,我们以HOXC8为例研究其在鼻咽癌中的生物学功能。我们将外源性HOXC8导入LMP1阳性鼻咽癌细胞系CNE1-LMP1,通过MTS方法发现HOXC8可显著抑制其增值,通过临床生化仪检测细胞培养基发现乳酸形成和葡萄糖消耗均显著降低,并发现HOXC8可显著抑制HK2和GLUT1等糖酵解关键基因的mRNA表达水平,上调TIGAR糖酵解负性调控因子表达,表明HOXC8可能具有抑制糖酵解的作用。同时,我们也发现HOXC8可以促进氧化磷酸化重要酶类SC02的表达,提示与之密切相关的三羧酸循环可能得到增强。因此,我们进一步检测了三羧酸循环中的一些重要酶类,例如2-羟基戊二酸脱氢酶(2-hydroxyglutaric acid dehydrogenase,2-HGDH)、琥珀酸脱氢酶复合物Ⅱ D(succinate dehydrogenase D, SDHD)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-ketoglutaratedehydrogenase, a-KGDH)包括OGDH, DLST、DLD三种亚基、延胡索酸(fumarate hydratase, FH)以及顺乌头酸酶(aconitase)包括ACO1和AC02等,发现HOXC8均能显著上调这些酶类的表达,并且呈现剂量依赖效应。这些研究进一步表明HOXC8可能直接靶向三羧酸循环中的重要酶类。 本课题以鼻咽癌为模型,研究了HOX基因表达谱与鼻咽癌之间的内在联系,发现HOX基因在EBV-LMP1阳性鼻咽癌中发生Pol Ⅱ Stalling,表达受到显著抑制。放射处理可诱导DNA损伤修复,其机制可能通过TET2和5hmC介导DNA去甲基化,影响Stalled Pol Ⅱ释放和HOX基因的重新活化。
【关键词】：鼻咽癌 HOX基因 Pol Ⅱ stalling TETs 5hmC DNA去甲基化 能量代谢
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R739.63
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-14
• 英文缩写注解14-16
• 第一章 鼻咽癌中HOX基因表达谱16-39
• 1.1 前言16-23
• 1.2 材料与方法23-31
• 1.2.1 材料23-25
• 1.2.1.1 细胞系23
• 1.2.1.2 质粒23-24
• 1.2.1.3 主要试剂和试剂盒24-25
• 1.2.1.4 主要仪器25
• 1.2.2 主要方法25-31
• 1.2.2.1 细胞培养25-26
• 1.2.2.2 细胞总RNA的抽提和浓度测定26
• 1.2.2.3 逆转录PCR26-27
• 1.2.2.4 Real-Time PCR27
• 1.2.2.5 感受态细菌的转化27
• 1.2.2.6 细菌培养及质粒抽提27-28
• 1.2.2.7 双荧光素酶报告基因28
• 1.2.2.8 免疫组化28-29
• 1.2.2.9 染色质免疫沉淀29-31
• 1.3 结果31-38
• 1.3.1 鼻咽癌细胞系中HOX基因的表达情况31-34
• 1.3.2 鼻咽癌组织中的HOX基因表达情况34-35
• 1.3.3 EBV LMP1抑制HOX基因启动子活性35-37
• 1.3.4 鼻咽癌中HOX基因受到PolⅡstalling调控37-38
• 小结38-39
• 第二章 放疗所致DNA损伤诱导HOX基因活化机制研究39-53
• 2.1 前言39-42
• 2.2 材料与方法42-46
• 2.2.1 材料42-43
• 2.2.1.1 细胞系42
• 2.2.1.2 主要试剂和试剂盒42
• 2.2.1.3 主要仪器42-43
• 2.2.2 主要方法43-46
• 2.2.2.1 激光共聚焦荧光显微镜(LCFM)检测43
• 2.2.2.2 彗星实验43-44
• 2.2.2.3 染色质免疫沉淀44
• 2.2.2.4 甲基化DNA免疫沉淀MeDIP44
• 2.2.2.5 PvuRts1I酶切鉴定5hmC变化44-46
• 2.3 结果46-52
• 2.3.1 放射处理诱导鼻咽癌细胞发生DNA损伤修复DDR46-48
• 2.3.2 DDR可诱使HOX基因重新活化48-49
• 2.3.3 放射处理促进Stalled HOX基因发生PolⅡ释放49-50
• 2.3.4 放射处理后HOX基因近端启动子区域发生DNA去甲基化50-52
• 小结52-53
• 第三章 HOX基因对鼻咽癌能量代谢的调节53-68
• 3.1 前言53-58
• 3.2 材料与方法58-62
• 3.2.1 材料58-59
• 3.2.1.1 细胞系58
• 3.2.1.2 质粒58-59
• 3.2.1.3 主要试剂和试剂盒59
• 3.2.1.4 主要仪器59
• 3.2.2 主要方法59-62
• 3.2.2.1 感受态细菌的转化59
• 3.2.2.2 细菌培养及质粒抽提59
• 3.2.2.3 细胞总RNA的抽提和浓度测定59
• 3.2.2.4 逆转录PCR59-60
• 3.2.2.5 Real-Time PCR60-61
• 3.2.2.6 MTS检测细胞增殖曲线61
• 3.2.2.7 葡萄糖消耗及乳酸形成测定61-62
• 3.3 结果62-67
• 3.3.1 HOXC8可抑制CNE1-LMP1细胞的增殖62-63
• 3.3.2 HOXC8对细胞能量代谢的影响63-67
• 小结67-68
• 分析与讨论68-72
• 总结论72-73
• 参考文献73-81
• 综述81-115
• Genome-wide distribution of DNA methylation and DNA demethylation and related chromatin regulators in cancer81-108
• References93-106
• 附图106-108
• DNA甲基化、SNP与肿瘤108-115
• 参考文献112-115
• 攻读学位期间的主要研究成果115-116
• 致谢116-117

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 王承兴,邓锡云,李晓艳,顾焕华,易薇,翁新宪,夏林庆,曹亚;EB病毒LMP1及其CTAR1、CTAR2导入人HNE2鼻咽癌细胞的研究[J];病毒学报;2001年04期

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本文编号：582117