microRNA-183家族在噪声性耳聋发生及发展中的表达及功能研究

发布时间：2017-08-13 00:18

  本文关键词：microRNA-183家族在噪声性耳聋发生及发展中的表达及功能研究

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【摘要】：噪声引起的慢性听力损失与耳蜗内的机械损伤和代谢障碍密切相关。人们如果持续在有害的噪声环境中工作或生活，由于噪声长时间的过度刺激很可能会导致耳蜗毛细胞坏死或者凋亡，耳蜗毛细胞内的氧自由基活动增强和能量代谢障碍被认为是导致内耳毛细胞坏死或者凋亡的主要原因。随着噪声性聋发病机制研究的深入，研究人员发现噪声性耳聋是环境和基因两个因素共同影响的。 miRNA在生物体发展过程中的作用已被广泛的研究，许多高保守性的miRNA在特定的细胞、器官和生物过程（包括疾病）中的作用也得到了充分的认识。其中miR-183家族在内耳中具有丰量的表达，并在内耳发育中具有重要的调控作用，而且miR-183家族与听力损失也有密切的关系。因此，miR-183家族与听力损失之间相关性的研究将成为热门。进而探索在基因水平上的治疗,特别是有关促使毛细胞再生领域及听力提高等方面。由此可见，miR-183家族在听力学领域有着不可估量的科学价值，同时也为人类的听力开辟一条新的光明之路。 本课题通过噪声频率为中心频率2000～4000Hz的窄带噪声，给声强度为100dB SPL,每天连续6小时，持续噪声暴露3天来建立小鼠的噪声性耳聋（noise-induced hearing loss,NIHL）的动物模型，探讨噪声性耳聋对内耳毛细胞（hair cell，HC）的破坏程度，及检测噪声性耳聋前后耳蜗内miR-183家族成员的表达变化，为进一步阐明噪声性耳聋的发病机制打下基础，也为将来治疗噪声性耳聋提供一条新的思路。本文共分为三个部分。 第一部分噪声性耳聋模型的建立 目的：建立噪声性耳聋动物模型，为研究噪声性耳聋对内耳毛细胞的破坏程度，及检测噪声性耳聋前后耳蜗内miR-183家族成员的表达变化奠定基础。 方法：50只小鼠随机分为5组（1、7、14、28d组及对照组），每组10只。实验组给予中心频率2000～4000Hz的窄带噪声，强度为100dB SPL,每天6小时，持续3天。对照组不接触噪声。在噪声刺激前及噪声刺激后1、7、14和28d后测ABR阈值。 结果：以能分辨出I或Ⅱ波波型的最低刺激强度来确定ABR阈值，并重复2次。噪声暴露后1d、7d、14d、28d组ABR平均阈值分别为62.50±3.80dB、44.50±4.56dB、40.25±4.13dB、40.50±3.20dB。统计分析示，实验组噪声刺激前后ABR阈值均有显著性差异(P0.01)。噪声刺激后，对照组与实验组每组之间差异有统计学意义（P0.01）,1d与7d、14d、28d组之间差异有统计学意义（P0.01），7d与14d、28d组之间差异有统计学意义（P0.05），14d与28d组间差异没有统计学意义（P0.05）。 结论：此噪声刺激可以引起小鼠听力的永久性阈移，证实基本成功地建立了噪声性听力损害的动物模型，为噪声性耳聋发病机制的研究打下了基础。 第二部分噪声性耳聋内耳毛细胞的研究 目的：检测噪声性耳聋后内耳毛细胞的破坏情况，为判定噪声通过损伤毛细胞来破坏听力提供依据。 方法：各组小鼠在麻醉后迅速断头处死，取其双侧听泡。用0.5%硝酸银溶液染色，再取其耳蜗基底膜进行铺片，用纯甘油封片，在倒置相差显微镜下观察并摄片，观察毛细胞破坏情况。 结果：正常对照组小鼠耳蜗第二回基底膜可见三排外毛细胞（红箭头）和一排内毛细胞（蓝箭头）均排列整齐，同时染色缺失率极小。清晰可见其外纤毛簇呈倒“v”形，内纤毛簇呈宽“u”形；1d组内毛细胞排列比较整齐，外毛细胞排列稍显混乱，且大小不一，但总体缺失仍较少；7d组内毛细胞依然排列比较整齐，但外毛细胞可见少量缺失；14d组外毛细胞可见有明显缺失，主要集中在第一、二排；28d组内毛细胞排列较整齐，未见有缺失，外毛细胞见大量缺失。 结论：此程度噪声可以引起内耳毛细胞破坏，，同时毛细胞的受损可能是小鼠噪声性耳聋的早期病理性改变，而且这个过程至少可以延续到28天。破坏主要在外毛细胞，且多集中在第一、二排。 第三部分miR-183家族在噪声性耳聋中的表达及研究 目的：检测噪声性耳聋前后耳蜗内miR-183家族成员的表达变化，来探讨miR-183家族是否参与了强噪声诱导耳蜗毛细胞破坏的调控机制。从而为进一步阐明噪声性耳聋的发病机制奠定基础。 方法：采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miR-183家族成员表达量的变化。采用SPSS17.0软件对数据进行分析。 结果： qRT-PCR检测显示，噪声刺激后1d和7d组三种基因(miR-183/96/182)的表达量较对照组均下降（P0.01），而1d与7d组间差异无统计学意义（P0.05）；14d组其表达量呈现明显的上升趋势（P0.01）；28d组较14d组表达量明显回降（P0.01），但仍高于1d、7d组（P0.01）。 结论： MicroRNA183家族成员在噪声刺激后的一段时间内表达量存在显著变化，可能作为特异性基因在噪声性耳聋发生发展中起到重要作用。
【关键词】：MicroRNA183家族 噪声性耳聋 毛细胞
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R764.433
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-13
• 第1章 前言13-15
• 第2章 噪声性耳聋动物模型的建立15-19
• 2.1 材料与方法15-16
• 2.1.1 实验设备15
• 2.1.2 实验动物15
• 2.1.3 噪声刺激15-16
• 2.1.4 听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)测试16
• 2.1.5 统计学处理16
• 2.2 结果16-17
• 2.3 讨论17-19
• 第3章 噪声性耳聋内耳毛细胞的研究19-24
• 3.1 材料与方法19-20
• 3.1.1 主要仪器及试剂19
• 3.1.2 基底膜硝酸银染色铺片19-20
• 3.1.3 结果判定标准20
• 3.2 结果20-21
• 3.3 讨论21-22
• 3.4 附图22-24
• 第4章 miR-183 家族在噪声性耳聋中的表达与研究24-32
• 4.1 材料与方法24-27
• 4.1.1 主要仪器及试剂24
• 4.1.2 主要方法及步骤24-27
• 4.1.3 实时定量 PCR 结果分析27
• 4.1.4 统计学处理27
• 4.2 结果27-28
• 4.2.1 1％琼脂糖凝胶电泳显示总 RNA27
• 4.2.2 实时定量 PCR27-28
• 4.3 讨论28-30
• 4.4 附图30-32
• 第5章 结论与展望32-33
• 5.1 结论32
• 5.2 展望32-33
• 致谢33-34
• 参考文献34-36
• 攻读学位期间的研究成果36-37
• 综述37-43
• 参考文献42-43

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本文编号：664409