小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究

发布时间：2017-09-23 11:09

  本文关键词：小鼠诱导性多潜能干细胞向内耳毛细胞和螺旋神经元诱导分化的体外实验研究

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【摘要】：研究背景： 感音神经性耳聋是耳鼻咽喉科常见疾病，研究证实其病理变化主要是耳蜗毛细胞及与其相连的螺旋神经元的缺失。同时也有研究显示哺乳动物耳蜗毛细胞及螺旋神经元受损后再生十分困难。如果能够找到某种方法修复缺失的毛细胞或螺旋神经节细胞，就有希望治愈感音神经性耳聋。2006年，日本科学家Shinya Yamanaka等通过导入Oct3/4，Sox2，c-Myc，Klf4四个外源基因将小鼠体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPSCs)。多项研究证实，iPSCs具有与胚胎干细胞(ESCs)类似的分化能力，却可以避免ESCs的免疫排斥及伦理道德问题，因此我们将iPSCs在体外诱导分化为耳蜗毛细胞及螺旋神经元，，为感音神经性耳聋的治疗的开辟新的道路。 研究内容和方法： 1.iPSCs的培养与鉴定：取小鼠胚胎成纤维细胞作饲养层，iPSCs接种于饲养层上胰酶消化传代，倒置显微镜下观察iPSCs生长状态，观察拟胚体(EB)形成能力，RT-PCR检测iPSCs多能性基因Oct4, Nanog, Sox2的表达情况。 2. iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养及其分化细胞的鉴定：分离小鼠耳蜗Corti氏器，将iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养。对分化细胞用毛细胞的标志物（MyosinVIIA，Math1，Calretinin，Espin）进行免疫组化鉴定。 3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养及其分化细胞的鉴定：分离小鼠耳蜗蜗轴，将iPSCs与耳蜗蜗轴共培养，对分化细胞用神经元的标志物(Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin，Vesicular glutamate transporter1(VGluT1))进行免疫组化鉴定。 结果： 1.成功建立稳定的iPSCs培养体系，iPSCs体外培养可形成EB。 RT-PCR显示iPSCs表达多能性基因Oct4, Nanog, Sox2。 2.iPSCs与耳蜗Corti氏器共培养18天后可得到表达毛细胞标志蛋白MyosinVIIA，Math1，Calretinin，Espin的细胞。 3.iPSCs与耳蜗蜗轴共培养18天后可得到表达神经元标志蛋白Nestin、Neurofilament-M、β-Ⅲ Tubulin，VGluT1的细胞。 结论： 本实验成功建立稳定的小鼠iPSCs培养体系；共培养方法可成功将iPSCs诱导分化为耳蜗毛细胞样及螺旋神经元样细胞。
【关键词】：诱导性多潜能干细胞 毛细胞 螺旋神经元 细胞分化
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R764.431
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-7
• 目录7-10
• 第1章 引言10-13
• 第2章 材料与方法13-25
• 2.1 实验材料13-16
• 2.1.1 实验动物及细胞系13
• 2.1.2 实验试剂13-15
• 2.1.3 实验主要培养基和试剂的配制15
• 2.1.4 实验主要仪器与耗材15-16
• 2.2 实验方法16-24
• 2.2.1 器材的准备16-17
• 2.2.2 原代 MEF 的分离培养与冻存17-18
• 2.2.3 MEF 的复苏、传代及饲养层细胞的制备18-19
• 2.2.4 小鼠 iPSCs 的复苏、传代培养及冻存19-20
• 2.2.5 小鼠 iPSCs 的鉴定20-22
• 2.2.6 小鼠 iPSCs 向内耳毛细胞及螺旋神经元诱导分化22-24
• 2.3 统计分析24-25
• 第3章 结果25-30
• 3.1 MEF 的形态学特点25
• 3.2 小鼠 iPSCs 的生长特点25
• 3.3 拟胚体的生长特点25-26
• 3.4 细胞经共培养诱导后的形态学特点26
• 3.5 诱导后细胞相关标志物的表达26-27
• 3.5.1 内耳毛细胞诱导分化组毛细胞相关标志物的免疫学鉴定结果26
• 3.5.2 螺旋神经元诱导分化组神经元相关标志物的免疫学鉴定结果26-27
• 3.6 统计学分析结果27-30
• 3.6.1 毛细胞诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析27-28
• 3.6.2 螺旋神经元诱导分化组细胞阳性率及其统计学分析28-30
• 第4章 讨论30-33
• 第5章 结论33-34
• 致谢34-35
• 参考文献35-38
• 附录 实验图片38-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 综述49-57
• 参考文献55-57

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 刘谦虚;谢鼎华;陈观贵;;脑源性神经营养因子基因转染骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞初步观察[J];听力学及言语疾病杂志;2009年03期

2 江红群;王正敏;沈云珍;李雯;;新生大鼠耳蜗增殖细胞的培养鉴定及超微结构观察[J];中华耳鼻咽喉头颈外科杂志;2007年01期

3 郑鸿燕;邰浩清;曾水林;周春祥;詹臻;王明艳;;耳蜗提取液诱导海马神经干细胞分化的实验研究[J];神经解剖学杂志;2006年05期

本文编号：904909