氧化石墨烯对SD大鼠神经系统毒性的体内外研究

发布时间：2018-05-22 07:09

  本文选题：氧化石墨烯 + 神经干细胞　； 参考：《重庆医科大学》2013年硕士论文

【摘要】：目的： 氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯经氧化处理后的衍生物，大小在十纳米到几百纳米乃至微米不等，在水中有很好的稳定性，表面分布有大量的羟基、环氧基，边缘分布有羧基和羰基等含氧活性基团[1,2]，有较高的荧光猝灭效率以及超强的吸附能力。这些独特的理化性质特别有利于对GO的表面修饰和功能化，以实现对药物的靶向装载和缓释作用等多种功能。因此GO在肿瘤的靶向治疗，细胞成像，生物传感器，生物检测等方面，显示了不可估量的应用前景[3-8]，深受生物医学领域的青睐。 纳米技术在给人类带来巨大利益的同时，也可能给人类及生态系统带来潜在的危险。这些纳米级的极小颗粒，容易进入生物体内，像小分子一样在身体各部分间自由穿梭，快速分布于除大脑以外的身体各器官组织中[9]，并与组织、细胞、细胞器和蛋白质等生物大分子相互作用，造成组织或细胞的功能异常，影响生物体的健康。也有研究发现，纳米材料还可以穿透血脑屏障。Kreuter等[10]发现，静脉注射聚山梨酯-80包裹的阿霉素纳米颗粒，可以被大脑毛细血管内皮细胞吞噬后穿透大鼠BBB。Oberd rster等[11]也证实，纳米材料也可以通过嗅神经通路进入中枢神经系统或者经感觉神经末梢直接转运至脑内。进入神经系统的纳米颗粒，还可以激活小胶质细胞产生ROS，诱发氧化应激反应、炎症反应，诱发神经毒性致使神经组织损伤。CNS是机体最重要的器官，它整合全身各组织器官的信息，调控着机体生理活动以及脑的高级活动。所以纳米材料对神经系统的生物安全性的评价有非常重要的临床意义，，也在很大程度上决定纳米材料的应用前景。 GO进入体内后，能否通过血脑屏障，对神经系统有何影响未见相关报道。因此本研究将通过体内外实验综合评价100～500nm大小的GO对神经系统的影响，为GO在多领域的应用提供客观和科学的实验依据。 第一部分：GO对SD大鼠的体内神经毒性研究 方法： 1GO表征鉴定 1.1高分辨透射电子显微镜（HRTEM）观察GO的表面特征。 1.2raman光谱检测GO表面基团。 1.3紫外扫描观察GO的吸收峰。 2动物实验 32只健康清洁级SD雄性大鼠（周龄4~5w，体重95±10g），随机分为对照组（生理盐水），2.5，5和10mg/kg/d体重3个GO实验组，8只/组，尾静脉注射GO到SD大鼠体内，1次/d，连续注射5d，休息2d，以测试动物的检测指标。连续注射4周，水迷宫实验后处死动物。实验期间分别观察并记录： 2.1一般情况：检测动物活动情况、精神状况，每日食物消耗量及体重变化。 2.2尾静脉给GO前以及第7d、14d、21d、28d，分别测试实验动物： Open-Field实验：以观察实验动物的神经精神活动； 功能观察组合实验（FOB）：综合评价实验动物的神经主动运动行为、中枢神经系统活动、中枢神经系统兴奋性、神经肌肉反应、感觉运动功能。 2.3实验第29d，Morris水迷宫检测实验动物的学习记忆以及空间探索功能。 2.4水迷宫实验后，取实验动物的大脑、小脑、坐骨神经及脊髓腰膨大，固定、包埋、切片、染色，光学及透射电子显微镜下行组织病理学观察。 结果： 1.大鼠一般状况良好，无死亡和疾病发生，各剂量组每日食物消耗量、体重变化均无显著性差异（p＞0.05）。 2. Open-Field实验中：各组实验动物的水平运动和垂直运动得分均无明显差异（p＞0.05）。 3. FOB综合实验中：各组实验动物的①一般活动及神经肌肉测试；②感觉运动及兴奋性测试；③自主性活动测试各指标间均无明显差异（p＞0.05）。 4. Morris水迷宫实验中，大鼠的逃避潜伏期及游泳距离与对照组相比均无显著性差异（p＞0.05），在原平台象限的游泳时间、原平台象限游程百分比以及穿越平台次数均无显著性差异（p＞0.05）。 5.形态学观察发现：TEM及光学显微镜下，大脑皮层、海马神经元、小脑、坐骨神经及脊髓腰膨均未见GO的颗粒存在，也未见明显的组织病理学改变。 结论： 中枢及外周神经系统中未见GO的颗粒存在，提示GO不能通过血脑及血脑脊液屏障，因此对实验大鼠的： 1.生长发育、神经精神状况、运动、感觉均没有明显影响。 2.学习记忆以及空间探索功能没有明显影响。 3.中枢及外周神经系统也未见明显的组织病理学改变。 第二部分：GO对神经干细胞和海马神经元的影响 方法： 1. GO的鉴定同上。 2.取SD孕鼠原代培养的二代神经干细胞（neural stem cells，NSCs）或培养6~7d的海马神经元接种于6孔或96孔板中，随机将其分为6组，即对照组（培养液中不加任何刺激因素），10,25,50,100和200μg/mL GO实验组，分别在培养液中加相应终浓度GO；作用24h或120h。 实验观察： 1.培养期间倒置相差显微镜观察各组细胞的形态特征。 2.培养24h或120h后： TEM观察NSCs及海马神经元的超微结构； MTT法检测NSCs及海马神经元的细胞存活率； 台盼蓝排斥实验检测细胞死亡率； 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞内ROS水平； LDH水平检测评估细胞膜的完整性。 结果： 1.细胞形态及超微结构：与对照组相比，GO实验组NSCs及海马神经元细胞形态及超微结构均正常。 2.细胞存活率：GO作用NSCs及神经元24h或120h，GO实验组细胞的存活率与相应对照组相比均无显著差异（p＞0.05）。 3.细胞死亡率：GO作用NSCs及神经元24h或120h后，GO实验组细胞死亡率与相应对照组均无显著性差异（p＞0.05）。 4.细胞膜完整性：GO作用NSCs及神经元24h或120h，GO实验组LDH漏出与相应对照组相比均无显著差异（p＞0.05）。 5.细胞凋亡：GO作用NSCs及神经元24h或120h，GO实验组细胞的凋亡或死亡与相应对照组相比无显著差异（p＞0.05）。 6.细胞内ROS检测：GO作用NSCs及神经元24h或120h，GO实验组细胞内ROS水平与相应对照组相比无显著差异（p＞0.05）。 结论： GO直接作用NSCs及海马神经元24h或120h均未引起明显的细胞毒性效应，其潜在的机制可能是：GO没有进入NSCs及神经元，也没有诱导细胞的氧化应激反应有关，提示GO与CNS具有良好的生物相容性。 结合体内外实验，我们认为GO对神经系统可能具有良好的生物相容性，对神经系统是安全的纳米材料。
[Abstract]:Objective:
Graphene oxide (GO) is a derivative of graphene after oxidation treatment. The size ranges from ten nanometers to hundreds of nanometers and even microns. It has a good stability in water. The surface has a large number of hydroxyl groups, epoxy groups, the distribution of carboxyl and carbonyl groups, such as [1,2], with high fluorescence quenching efficiency and excess. These unique physical and chemical properties are particularly beneficial to the surface modification and functionalization of GO, so as to achieve the target loading and sustained release of drugs, so GO has shown an immeasurable application prospect, [3-8], in the tumor targeting therapy, cell imaging, biosensor, biological detection and so on, and is deeply affected by biological medicine. The favor of the field of learning.
Nanotechnology, while bringing great benefits to human beings, can also bring potential hazards to humans and ecosystems. These nanoscale tiny particles are easily accessible to organisms, like small molecules, freely shuttle between parts of the body, fast distributed in the tissues of the body except the brain, [9], and tissue, cells, and cells. Biological macromolecules such as organelles and proteins interact with each other, causing abnormal function of tissues or cells and affecting the health of organisms. Some studies have also found that nanomaterials can also penetrate the [10] of the blood brain barrier.Kreuter and so on. The doxorubicin nanoparticles encapsulated by polysorbate -80 can be phagocytic after phagocytosis of cerebral capillary endothelial cells. [11], which penetrates the rat BBB.Oberd rster, also confirms that nanomaterials can also enter the central nervous system or transshipment directly into the brain through the olfactory nerve pathway. The nanoparticles entering the nervous system can also activate the microglia to produce ROS, induce oxidative stress, inflammation, and induce neurotoxicity. Tissue injury.CNS is the most important organ of the body. It integrates the information of all organs and organs of the body, regulates the physiological activities of the body and the advanced activities of the brain. Therefore, the evaluation of the biosafety of the nervous system by nano materials has very important clinical significance, and it also determines the prospect of the application of nanomaterials to a great extent.
When GO enters the body, there is no related report on whether the blood brain barrier can affect the nervous system. Therefore, this study will evaluate the effects of 100 ~ 500nm of GO on the nervous system through the experiment in vitro and in vivo, and provide an objective and scientific basis for the application of GO in many fields.
Part one: the neurotoxicity of GO on SD rats
Method锛

本文编号：1920982