伏马菌素免疫及化学检测和黄曲霉菌特异抗体表达分析
发布时间：2020-11-17 11:06
伏马菌素(Fumonisins)是以串珠镰刀菌(Fusarium verticillioides)和再育镰刀菌(F.proliferatum)为主的致病菌产生的真菌毒素,严重污染玉米、高粱、水稻等多种粮食作物及其产品。伏马菌素可引起人、畜中毒,具有潜在的致癌性,其中伏马菌素B1(FB1)已被国际癌症研究机构认定为2B类致癌物。FDA和欧盟对食品和饲料中该毒素量规定严格的控制标准。因此,发展伏马菌素的快速、准确的检测技术,分析我国主要镰刀菌的产毒类型,对于保障食品安全和人、畜健康具有重要意义。黄曲霉菌(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)产生的黄曲霉毒素,具有强烈的致癌和致畸作用,已被国际癌症研究中心认定为I类致癌物。在我国黄曲霉菌是形成黄曲霉毒素的主要真菌。黄曲霉菌特异抗体既可用于免疫检测产毒菌,也可用于防治或消除黄曲霉菌及其毒素。因此,表达、分析基于我国代表性黄曲霉菌菌株筛选的特异抗体,将为进一步有效利用这些抗体提供资料。本实验围绕伏马菌素免疫及化学检测和黄曲霉菌特异抗体表达开展了研究,取得的主要结果如下:1.以镰刀菌种群特异引物分子鉴定分离的温暖镰刀菌(F.temperatum)、胶孢镰刀菌(F.subglutinans)和串珠镰刀菌(F.verticillioides)的菌种类型,同时以毒素合成关键基因为靶位点,对3种镰刀菌的产毒类型进行了分子检测。结果表明,串珠镰刀菌具有伏马菌素的产毒基因,而温暖镰刀菌和胶孢镰刀菌没有该基因。2.在玉米培养基中接种3种不同类型的镰刀菌,用于检测菌株的产毒类型和产毒量。利用液相色谱质谱联用仪(LC-MS/MS)对毒素进行化学检测,结果表明串珠镰刀菌可以产生伏马菌素,而温暖镰刀菌和胶孢镰刀菌不能产生。此外,利用酶联免疫法(ELISA)对毒素进行免疫学检测,结果与化学检测一致,同时这两项检测结果与分子检测具有很好的一致性。结合分子检测、化学检测及免疫学检测结果,表明在这3种类型的镰刀菌中,只有串珠镰刀菌是伏马菌素的产生菌。3.将两个对黄曲霉菌细胞壁蛋白亲和力较强的单链抗体(sc Fv3和sc Fv12),通过3中不同的连接短肽(218linker,G4S,(G4S)3)构建二聚体抗体,并进行原核生物过量表达和亲和层析纯化。SDS-PAGE电泳和Western blot分析表明,三种二聚体抗体均可在原核表达体系中表达,为大量制备抗体用于黄曲霉菌检测分析打下了基础。4.利用抗菌肽(MSI99和AFP2)和抗黄曲霉细胞壁蛋白单链抗体(sc Fv3和sc Fv12)构建了8种不同组合的植物表达载体,其中包括以抗菌肽或单链抗体单独构建的载体以及抗菌肽-单链抗体融合基因的载体。通过农杆菌介导法转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),成功获得转基因阳性植株,通过温室加代及各世代分子鉴定,已培养至T3代。5.利用半定量PCR方法对转基因拟南芥T3代阳性植株进行转录水平的鉴定,结果表明,抗菌肽、单链抗体及其抗菌肽-单链抗体融合基因在T3代植株中均可被转录。还探索了拟南芥离体叶片接种黄曲霉菌孢子的方法,发现黄曲霉孢子可以侵染拟南芥叶片,但不能扩展。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S859.8;R114
【部分图文】：
1.1.2 伏马菌素生物合成相关基因伏马菌素是一类水溶性的真菌毒素，具有致畸致癌的作用，存在于多种作物及食品饲料中，对人类的健康存在巨大的威胁。研究发现菌株产生伏马菌素是由产毒基因遗传的（Desjardins et al 1992）。伏马菌素生物合成的具体机制并不清楚但与其合成相联系的 17 个基因处于同一基因族。其中多肽酮合成酶（PKS）由 fu基因编码，fum1 是调控伏马菌素合成的所必需的，fum1 基因缺失或者失活，导致株无法合成伏马菌素，而其他基因失活导致部分毒素无法合成、毒素种类改变或素含量降低。在串珠镰刀菌研究中，现已对部分 fum1 基因功能进行了大胆预测和证（Alexander et al 2009）。因此很多研究从分子水平上，以是否还有 fum1 基因来为判断菌株产伏马菌素的标准。1.1.3 伏马菌素的毒理研究图 1 伏马菌素 B 类的化学结构（Lazzaro et al 2012）Fig.1 Chemical structure of B-series fumonisins（Lazzaro et al 2012）
3 结果与分析3.1 伏马菌素的检测3.1.1 菌株鉴定3.1.1.1 菌株形态观察3 种类型的菌株的孢子液调整浓度为 5×105个/mL，每个菌株取 10 μL 接种至PDA 培养皿（直径为 9 cm）中央，28 ℃恒定温度条件倒置培养 5 d 后观察菌株形态，结果如图 2 所示。图中编号 A-E 为温暖镰刀菌，F-G 为胶孢镰刀菌，H-J 为串珠镰刀菌，所有菌株均为本实验室从田间小麦、玉米分离得到。图中所有菌株菌丝较为稀疏，尤其是温暖镰刀菌菌株。其中温暖镰刀菌气生菌丝较少，贴壁生长，产生淡紫色或浅粉色的色素，而串珠镰刀菌菌株（H-J）的菌丝生长较快、相对厚实，产生紫色色素。胶孢镰刀菌菌株生长速度介于他们两者之间，产淡紫色色素。
1 均能扩增出预期大小片段，而引物 FUM1-F-菌株中扩增出条带，另外两种菌株没有目的条因，所以我们确定只有串珠镰刀菌菌株具有产株没有该基因，推测其可能不能产生伏马菌素AM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图 3 菌株种类鉴定Fig.3 Identification of strains species marker；泳道 1：M18059；泳道 2：M18061；泳道 3：M18063道 6：M16084；泳道 7：M20020；泳道 8：M5332；泳道 9：Ger; Lane 1: M18059; Lane 2: M18061; Lane 3: M18063; Lane 6: M16084; Lane 7: M20020; Lane 8: M5332; Lane 9: GLOX;bp－
【参考文献】
本文编号：2887431
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S859.8;R114
【部分图文】：
1.1.2 伏马菌素生物合成相关基因伏马菌素是一类水溶性的真菌毒素，具有致畸致癌的作用，存在于多种作物及食品饲料中，对人类的健康存在巨大的威胁。研究发现菌株产生伏马菌素是由产毒基因遗传的（Desjardins et al 1992）。伏马菌素生物合成的具体机制并不清楚但与其合成相联系的 17 个基因处于同一基因族。其中多肽酮合成酶（PKS）由 fu基因编码，fum1 是调控伏马菌素合成的所必需的，fum1 基因缺失或者失活，导致株无法合成伏马菌素，而其他基因失活导致部分毒素无法合成、毒素种类改变或素含量降低。在串珠镰刀菌研究中，现已对部分 fum1 基因功能进行了大胆预测和证（Alexander et al 2009）。因此很多研究从分子水平上，以是否还有 fum1 基因来为判断菌株产伏马菌素的标准。1.1.3 伏马菌素的毒理研究图 1 伏马菌素 B 类的化学结构（Lazzaro et al 2012）Fig.1 Chemical structure of B-series fumonisins（Lazzaro et al 2012）
3 结果与分析3.1 伏马菌素的检测3.1.1 菌株鉴定3.1.1.1 菌株形态观察3 种类型的菌株的孢子液调整浓度为 5×105个/mL，每个菌株取 10 μL 接种至PDA 培养皿（直径为 9 cm）中央，28 ℃恒定温度条件倒置培养 5 d 后观察菌株形态，结果如图 2 所示。图中编号 A-E 为温暖镰刀菌，F-G 为胶孢镰刀菌，H-J 为串珠镰刀菌，所有菌株均为本实验室从田间小麦、玉米分离得到。图中所有菌株菌丝较为稀疏，尤其是温暖镰刀菌菌株。其中温暖镰刀菌气生菌丝较少，贴壁生长，产生淡紫色或浅粉色的色素，而串珠镰刀菌菌株（H-J）的菌丝生长较快、相对厚实，产生紫色色素。胶孢镰刀菌菌株生长速度介于他们两者之间，产淡紫色色素。
1 均能扩增出预期大小片段，而引物 FUM1-F-菌株中扩增出条带，另外两种菌株没有目的条因，所以我们确定只有串珠镰刀菌菌株具有产株没有该基因，推测其可能不能产生伏马菌素AM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10图 3 菌株种类鉴定Fig.3 Identification of strains species marker；泳道 1：M18059；泳道 2：M18061；泳道 3：M18063道 6：M16084；泳道 7：M20020；泳道 8：M5332；泳道 9：Ger; Lane 1: M18059; Lane 2: M18061; Lane 3: M18063; Lane 6: M16084; Lane 7: M20020; Lane 8: M5332; Lane 9: GLOX;bp－
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 田长恩,王正询,陈韬,周玉萍,黄自然,黄亚东;抗菌肽D基因导入番茄及转基因植株的鉴定[J];遗传;2000年02期
2 贾士荣,屈贤铭,冯兰香,唐惕,唐益雄,刘坤,赵艳丽,白永延,蔡敏莺;转抗菌肽基因提高马铃薯对青枯病的抗性[J];中国农业科学;1998年03期
3 方宏筠,王关林,王火旭,贾士荣,董云洲,唐益雄;抗菌肽基因转化樱桃矮化砧木获得抗根瘤病的转基因植株[J];植物学报;1999年11期
本文编号：2887431
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