PAS-Na对染锰大鼠脑炎症反应的影响

发布时间：2018-06-11 14:08

本文选题：对氨基水杨酸钠 + 锰　；参考：《广西医科大学》2017年博士论文

【摘要】：【目的】锰是人体必需微量元素,但长期过量锰暴露可引起锰中毒。锰中毒不仅损伤锥体外系,而且累及脑的其他部位包括皮层、海马和丘脑。炎症是神经退行性疾病的一个重要过程,且MAPK信号通路可能是锰神经毒性的主要靶通路。体内外研究显示,非甾体抗炎药通过抑制炎症反应和小胶质细胞活性来干预多巴胺能神经元的进行性退化,具有保护神经作用。对氨基水杨酸钠(PAS-Na)是一种非甾体抗炎类药物,我室率先应用PAS-Na治疗锰中毒病人效果较好。本研究拟通过体内毒理学试验,采用石墨炉原子吸收光谱法、免疫组化、酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)、Real-Time PCR和Western Blot等技术从MAPK信号通路探讨锰致大鼠皮层、海马和丘脑炎症反应及PAS-Na的干预机制。【方法】动物分组及处理:SPF级雄性成年SD大鼠适应性喂养1周后,(1)短期重复实验:SPF级雄性SD大鼠40只,体重(184.5±10.7)g,随机分为染锰组和正常对照组(对照组),每组20只。染锰组腹腔注射(ip)15 mg Mn Cl2/kg,对照组ip等容量生理盐水,每日1次,每周5天,连续4周。(2)亚慢性实验:SD雄性大鼠,体重(80±20)g,随机分为对照、高剂量PAS-Na对照组(PAS对照)、染锰、PAS-Na预防性干预(PAS预防)组和低、中、高剂量PAS-Na(L-、M-、H-PAS)治疗组,观察期为8、12、18周。染锰、PAS预防及各剂量PAS-Na治疗组ip 15 mg Mn Cl2/kg,对照组和观察期18周的PAS对照组ip等容量生理盐水,每日1次,每周5天,连续8或12周;其中PAS预防组在染锰的同时,每天背部皮下注射(sc)240 mg PAS-Na/kg,每天一次,每周5天,连续8和12周;观察期8或12周的PAS对照组每天背部皮下sc 240 mg PAS-Na/kg,每天一次,每周5天,连续8或12周。然后,L-、M-、H-PAS治疗组及观察期18周的PAS对照组分别sc 80、160、240 mg、240 mg PAS-Na/kg,其余组背部sc等容量生理盐水,每日1次,每周4天停药3天,连续6周。使用的各剂量PAS-Na溶液的PH约为6.7左右;Mn Cl2 PH为5.5至5.7左右。实验指标测定:(1)生长发育指标检测:每周日称动物体重1次;实验结束时,处死动物,取软组织脏器包括心、脾、肝、肺、睾丸、肾等脏器,并称重,计算其脏器系数比;(2)空间学习记忆能力检测:实验结束前1周,每组随机抽取10只动物进行Morris水迷宫实验以测试其学习记忆能力改变;(3)石墨炉原子吸收光谱法测定全血锰和脑锰(丘脑、海马和皮层)含量;(4)免疫组化检测皮层、海马和丘脑胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、bax、bcl-2、caspese3阳性细胞表达;(5)炎症因子改变检测:酶联免疫吸附测定法检测皮层、海马和丘脑TNF-α、IL-1β、IL-6和PGE2炎症因子含量;实时荧光定量PCR(RT-PCR)法测定TNF-α、IL-1β、IL-6和COX-2 m RNA表达量;(6)蛋白免疫印迹法(WB)测定MAPK通路的T-/p-JNK、ERK、p38及COX-2蛋白表达。【结果】(1)PAS-Na对染锰大鼠生长发育的影响:于染锰第三或第四周起,染锰组大鼠体重比对照组轻。亚慢性试验(观察期8和12周):染锰第五和第六周,PAS预防组大鼠体重较染锰组重;PAS-Na单独作用第三周,PAS对照组大鼠体重比对照组轻(P0.05)。亚慢性试验(观察期18周)治疗第五和第六周,M-和H-PAS组大鼠体重比染锰组重(P0.05);其中PAS对照组于第三周的体重比对照组轻(P0.05);除了上述时间外,PAS预防或PAS治疗均对染锰大鼠体重无显著性作用。(2)PAS-Na对染锰大鼠脏器系数的影响:观察期4周,染锰组大鼠脾脏和肾脏系数比对照组大(P0.05);与对照组比较,染锰组大鼠心脏、肝和睾丸系数无显著性变化(p0.05)。观察期8周,与对照组相比,染锰组大鼠心、肝、脾和肾脏系数升高(P0.05);而PAS预防组脾脏系数比染锰组低(P0.05);PAS预防组大鼠心、肝和肾脏系数与染锰组比较无显著性差异(P0.05)。观察期12周,染锰组心、肾脏、睾丸和肺系数比对照组低,PAS预防组的睾丸系数比染锰组高(P0.05);PAS预防组大鼠心和肾脏系数与染锰组比较无显著性变化(P0.05)。观察期18周,与对照组比较,染锰组大鼠心脏和睾丸系数降低,肝脏系数升高(P0.05或0.01);与染锰组比较,H-PAS组大鼠心脏系数升高,肝脏系数减低,差异有统计学差异(P0.05)。(3)PAS-Na对染锰大鼠空间学习记忆能力的影响:各组大鼠平均逃避潜伏期均随着测试天数的增加而减少。短期重复试验即观察期4周,染锰组大鼠在测试第1、4、5天的逃避潜伏期和游泳路程比对照组长(P0.05或0.01)。观察期8周,染锰组大鼠在测试第1、3、4、5天的平均逃避潜伏期和游泳路程较对照组长(P0.05或0.01);而PAS预防组大鼠在测试第3、4、5天平均逃避潜伏期和游泳路程较染锰组短(P0.01)。观察期12周,染锰组大鼠在测试第2、3、4、5天的平均逃避潜伏期和游泳路程较对照组长(P0.05或0.01);而PAS预防组大鼠在测试第4和5天平均逃避潜伏期和游泳路程较染锰组短(P0.05或0.01)。观察期18周,染锰组大鼠在测试第3、4、5天的平均逃避潜伏期和游泳路程较对照组长(P0.05或0.01);而M-PAS和H-PAS组大鼠在测试第3、4和5天平均逃避潜伏期和游泳路程较染锰组短(P0.05或0.01)。各时期的PAS-Na对照组的平均逃避潜伏期和游泳路程与对照组比较无显著性差异(P0.05)。定位航行实验结束后第二天,进行空间探索实验。观察期4周,与对照组比较,染锰组大鼠平台象限时间百分和穿越平台次数降低(P0.05)。观察期8周,染锰组大鼠平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均比对照组低(P0.05或0.01);PAS预防组大鼠穿越平台次数比染锰组高(P0.01)。观察期12周,染锰组大鼠平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均比对照组低(P0.01);PAS预防组大鼠平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均比染锰组高(P0.05或0.01)。观察期18周,染锰组大鼠平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数均比对照组低(P0.01);M-和H-PAS组大鼠平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数比染锰组高(P0.05或0.01)。各时期的PAS对照组大鼠的平台象限路程百分比、时间百分比和穿越平台次数与相应时期的对照组比较无显著性差异(P0.05)。各时期,各组大鼠的游泳速度无显著性差异(P0.05)。(4)PAS-Na对染锰大鼠血锰浓度和脑锰浓度的影响:短期重复实验中,染锰组大鼠血锰和丘脑锰含量比对照组高(P0.05);在亚慢性毒性实验中,观察期8、12和18周均发现染锰组大鼠血锰和脑锰(皮层、海马和丘脑)浓度均比对照组高。其中,脑锰浓度(皮层、海马和丘脑)随着染锰时间延长而有一定的时间反应关系。PAS预防或治疗组大鼠血锰和脑锰浓度(皮层、海马和丘脑)浓度均低于染锰组。(5)PAS-Na对染锰大鼠皮层、海马和丘脑GFAP阳性细胞的表达量的影响:短期重复实验(观察期4周),染锰组大鼠丘脑GFAP阳性细胞表达量比对照组高(P0.05)。亚慢性实验:观察期8周,染锰组大鼠丘脑GFAP阳性细胞表达量比对照组高(P0.01);与染锰组比较,PAS预防组大鼠丘脑GFAP阳性细胞表达量降低(P0.01)。观察期12周,染锰组大鼠丘脑、海马和皮层GFAP阳性细胞表达量均比对照组高(P0.01);PAS-Na干预使染锰大鼠丘脑和皮层GFAP阳性细胞表达量降低(P0.05);而对染锰大鼠海马GFAP阳性细胞表达量无影响。观察期18周,与对照组相比,染锰组大鼠丘脑、海马和皮层GFAP阳性细胞表达量升高(P0.01);M-和H-PAS组大鼠丘脑GFAP、M-PAS组大鼠海马GFAP阳性细胞表达量比染锰组低(P0.01);PAS-Na治疗对锰致大鼠皮层GFAP阳性细胞表达量改变无显著性影响(P0.05)。各时期的PAS对照组大鼠丘脑、海马和皮层GFAP阳性细胞表达量与对照组比较无显著性差异(P0.05)。(6)PAS-Na对染锰大鼠皮层、海马和丘脑bax、bcl-2及caspese-3阳性细胞的表达量的影响:短期重复实验(观察期4周),染锰组大鼠丘脑caspase-3阳性细胞表达量比对照组高,bcl-2阳性细胞表达量比对照组低(P0.05);与对照组比较,染锰组大鼠丘脑bax阳性细胞表达量无显著性变化,但bcl-2/bax比值比对照组低(P0.05)。观察期8周,与对照组比较,染锰组大鼠丘脑caspase-3阳性细胞表达量升高,bcl-2阳性细胞表达量和bcl-2/bax比值降低(P0.05);与染锰组比较,PAS预防组大鼠丘脑caspase-3、bcl-2阳性细胞表达量和bcl-2/bax比值无明显差异(P0.05)。观察期12周,染锰组大鼠丘脑、海马和皮层caspase-3及海马bax阳性细胞表达量比对照组高,bcl-2阳性细胞表达量和bcl-2/bax比值比对照组低(P0.01);但染锰对大鼠丘脑和皮层bax阳性细胞表达量无影响;PAS-Na干预使大鼠丘脑和海马caspase-3及海马bax阳性细胞表达量降低,大鼠丘脑和海马bcl-2阳性细胞表达量和bcl-2/bax比值升高(P0.05或0.01);但PAS-Na干预对染锰大鼠皮层caspase-3阳性细胞表达量、bcl-2阳性细胞表达量和bcl-2/bax比值无影响。观察期18周,与对照组相比,染锰组大鼠丘脑、海马和皮层caspase-3和bax阳性细胞表达量均升高,bcl-2和bcl-2/bax比值降低(P0.01);M-或H-PAS组大鼠丘脑caspase-3和bax阳性细胞表达量比染锰组低,bcl-2和bcl-2/bax比值比染锰组高,差异有统计学意义(P0.05或0.01);M-和H-PAS组大鼠海马caspase-3阳性细胞表达量比染锰组低(P0.05或0.01);PAS-Na治疗对锰致大鼠海马bcl-2、bax和bcl-2/bax比值改变无显著性影响。与染锰组比较,M-或H-PAS组大鼠皮层caspase-3和bax阳性细胞表达量比染锰组低,皮层bcl-2和bcl-2/bax比值升高(P0.05或0.01);PAS对照组大鼠皮层caspase-3阳性细胞表达量比对照组高(P0.01,)。各时期的PAS对照组上述阳性细胞表达量与对照组比较无明显差异。(7)PAS-Na对染锰大鼠血清、皮层、海马和丘脑炎症因子含量的影响:观察期4周,染锰组大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α、丘脑IL-1β和PGE2含量比对照组高(P0.05或0.01);与对照组比较,染锰组血清PGE2、丘脑TNF-α和IL-6含量无显著性变化(P0.05)。观察期8周,染锰组大鼠血清IL-6、IL-1β、PGE2及TNF-α、丘脑IL-1β和PGE2含量含量均比对照组高(P0.05或0.01);但染锰对丘脑TNF-α和IL-6含量无显著性变化(P0.05);与染锰组比较,PAS预防组大鼠血清IL-1β、TNF-α、丘脑IL-1β和PGE2含量降低(P0.05);PAS预防组大鼠血清IL-6和PGE2含量与染锰组无显著性差异(P0.05)。观察期12周,染锰组大鼠血清、丘脑、海马及皮层IL-1β、IL-6、PGE2和TNF-α含量均比对照组高(P0.05或0.01);PAS-Na干预使血清IL-1β和TNF-α、丘脑IL-1β和PGE2、海马TNF-α和皮层IL-1β含量降低(P0.01)。与染锰组比较,H-PAS组大鼠海马IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α含量降低(P0.05或0.01);染锰12周停止染锰6周,大鼠血清及各脑组织IL-6、IL-1β、PGE2和TNF-α含量仍比对照组高(P0.05或0.01);L-、M-和H-PAS组大鼠血清IL-1β和IL-6含量比染锰组低;与染锰组比较,M-PAS组大鼠丘脑IL-6含量和H-PAS组大鼠丘脑PGE2和TNF-α含量减低(P0.05或0.01);与染锰组比较,M-PAS组大鼠皮层IL-1β含量和H-PAS组大鼠皮层IL-6、TNF-α和PGE2含量降低(P0.05或0.01)。各时期的PAS对照组大鼠血清和各脑组织炎症因子含量与对照组比较无显著性差异(P0.05)。(8)PAS-Na对染锰大鼠丘脑IL-1β、IL-6、COX2和TNF-αm RNA表达的影响:染锰4周使大鼠丘脑IL-1β和COX-2 m RNA表达上调,其中以COX-2 m RNA表达变化最明显(P0.05或0.01);与对照组比较,染锰组大鼠丘脑IL-6和TNF-α表达升高,但差异无统计学意义(P0.05)。观察期8周,与对照组相比,染锰组大鼠丘脑IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表达升高(P0.05或0.01),而丘脑IL-6 m RNA无显著性变化(P0.05);与染锰组比较,PAS预防组大鼠丘脑IL-1β和COX-2 m RNA表达降低(P0.05),而丘脑TNF-αm RNA无显著性变化(P0.05)。观察期12周,染锰组大鼠各脑组织(包括丘脑、海马和皮层)IL-6、IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表达均比对照组高(P0.05或0.01);与染锰组比较,PAS预防组大鼠丘脑TNF-α、COX-2、海马及皮层IL-6、IL-1β、TNF-αm RNA表达降低(P0.05),而丘脑IL-6、IL-1β、海马及皮层COX-2 m RNA无显著性变化(P0.05)。观察期18周,染锰组大鼠皮层IL-6、IL-1β、TNF-α和COX-2m RNA表达仍比对照组高;染锰组大鼠丘脑IL-1β、PGE2、TNF-α、海马IL-6、IL-1β和TNF-αm RNA比对照组高(P0.05或0.01);高剂量PAS-Na治疗六周使上述锰引起上调的丘脑IL-1β、COX-2和TNF-αm RNA表达降低(P0.05);高剂量PAS-Na治疗六周使上述锰引起上调的海马IL-1β和IL-6 m RNA表达降低(P0.05);但PAS-Na治疗对锰引起海马TNF-αm RNA上调无明显作用。高剂量PAS-Na治疗六周使上述锰引起上调的皮层炎症因子m RNA表达降低(P0.05或0.01)。各时期的PAS对照组大鼠各脑组织炎症因子m RNA表达与对照组比较无显著性差异(P0.05)。(9)PAS-Na对染锰引起丘脑MAPK通路相关蛋白表达改变的影响:观察期4周,染锰组大鼠丘脑COX-2蛋白表达、p-ERK/T-ERK、p-P38/T-P38和p-JNK/T-JNK比值升高,即染锰促进丘脑p38、ERK和JNK的磷酸化。亚慢性毒性试验中,观察期8周均观察到染锰组丘脑COX-2蛋白表达、p-ERK/T-ERK、p-JNK/T-JNK和p-P38/T-P38比值均比对照组高(P0.05或0.01);与染锰组比较,PAS预防组JNK和p38的磷酸化降低(P0.01);但PAS-Na预防对锰致p38、EKR磷酸化和COX-2蛋白表达升高无明显作用。观察期12周,与对照组比较,染锰组大鼠丘脑COX-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、海马COX-2、p-ERK、p-p38、皮层COX-2和p-ERK蛋白表达均升高(P0.01);与染锰组比较,PAS-Na预防组大鼠丘脑、海马和皮层COX-2表达降低(P0.05)。染锰12周停止染锰6周,染锰大鼠丘脑COX-2、p-ERK、p-JNK、p-p38、海马COX-2、p-ERK、p-p38及皮层COX-2蛋白表达仍比对照组高(P0.05或0.01);PAS-Na治疗对上述蛋白表达均有一定的拮抗作用。各个时期的PAS对照组MAPK相关蛋白和COX-2蛋白表达量与对照组比较无显著性差异。【结论】(1)染锰引起大鼠体重增长缓慢、心、肾脏、脾、睾丸和肺系数改变,PAS-Na干预和治疗对染锰大鼠体重和脏器系数改变有一定程度的改善。PAS-Na对大鼠消化道有一定的影响,以至累及大鼠体重增长。(2)短期及亚慢性染锰都可影响大鼠学习能力,但其记忆功能改变仅出现在亚慢性锰暴露阶段。PAS-Na治疗或预防均可拮抗锰暴露所致的学习记忆功能改变。(3)染锰引起大鼠血锰和脑锰(皮层、海马和丘脑)浓度升高,其中脑锰浓度随着染锰时间延长而升高。PAS-Na干预和治疗均具有促排锰作用。(4)染锰可使大鼠皮层、海马和丘脑GFAP、Caspese-3阳性细胞的表达量升高,bcl-2阳性细胞表达量及bcl-2/bax比值降低;PAS-Na预防和/或治疗对锰引起皮层、海马和丘脑GFAP、Caspese-3阳性表达升高、bcl-2阳性细胞表达量及bcl-2/bax比值降低具有一定的拮抗作用。(5)染锰引起大鼠血清、皮层、海马和丘脑炎症因子含量升高及且相关的m RNA表达上调。PAS-Na预防和/或治疗对锰引起血清、皮层、海马和丘脑炎症反应具有一定的拮抗作用。(6)锰可能通过MAPK通路引起大鼠皮层、海马和丘脑炎症反应,其中以激活COX-2蛋白表达、ERK和p38磷酸化为主。PAS-Na预防和/或治疗可能通过MAPK通路拮抗锰引起的大鼠皮层、海马和丘脑炎症反应。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R114

【参考文献】