氧化应激损伤在赭曲霉毒素A诱导细胞周期阻滞中的作用及其可能机制的研究

发布时间：2018-08-13 13:56

【摘要】：饮食及环境中真菌毒素的污染是人类面临的重要公共卫生问题，它与人类疾病的发生关系密切。2006年，在对我国胃癌高发区之一的河北省赞皇县（胃癌年均死亡率为77.67/10万）居民食用小麦检测时发现赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）的检出率高达45.16%，当地居民OTA的日暴露量为1.17μg/kg，远远超过世界卫生组织/粮农组织联合专家委员会（Joint FAO/WHO Expert Committee on FoodAdditives，JECFA）暂定的每周允许摄入量100ng/kg。说明当地居民进食OTA污染粮食可能与胃癌的发生发展有密切关系。 OTA是由曲霉菌属和青霉菌属的某些菌株产生的一种污染广泛的真菌毒素，普遍存在于粮食、饮料、饲料和动物组织中。OTA化学性质稳定，在血液中的半衰期是35天。流行病学调查数据显示OTA可能与巴尔干地方性肾病、慢性间质性肾病和泌尿系上皮肿瘤有关。体内、外实验研究发现，OTA具有肾毒性、肝毒性、神经毒性、免疫毒性和致畸性。因此，国际癌症研究中心（InternationalAgency for Research on Cancer，IARC）将OTA列为“B级可能人类致癌物”。研究发现许多致癌性真菌毒素早期毒性作用是导致细胞增殖抑制、细胞周期阻滞和凋亡。在针对OTA致胃癌可能机制的研究中，我们的前期体外实验发现OTA可以抑制人胃黏膜上皮细胞GES-1细胞增殖，通过MAPK（p38，ERK）信号通路和ATM（ATM-Chk2，ATM-p53-p21WAF1/CIP1）信号通路介导G2期阻滞，并且诱导细胞凋亡。实验揭示OTA诱导胃组织的靶细胞-胃黏膜上皮细胞细胞周期G2期阻滞可能在胃癌的发生发展过程中起重要作用。但是引起这一系列细胞级联反应的原因及其上游事件并不清楚。探讨OTA这一生物学效应可能对进一步认识其参与胃癌发生的可能机制具有重要意义。 OTA的潜在致癌性在二十世纪七十年代被认可，但是其致癌机制至今并不十分清楚。JECFA等专家组织在一些高度可能的机制中，越来越聚焦于氧化应激机制。研究发现，很多致癌性真菌毒素都可以诱导细胞DNA氧化应激损伤，进而导致细胞周期阻滞或凋亡。已有文献报道OTA可以诱导人肝细胞和肾脏细胞DNA氧化应激损伤。活性氧（reactiveoxygen species，ROS）对生物大分子（特别是DNA）的氧化损伤被认为是启动和促进肿瘤发生的最重要因素。细胞周期检测点的激活和修复系统的启动是DNA损伤引发的细胞级联反应，这使得细胞在复制前或有丝分裂前有足够的时间修复受损DNA，修复成功的细胞脱离周期阻滞进入细胞周期；修复失败的细胞会发生凋亡，这对于维持基因组的稳定性有重要意义。线粒体是细胞进行电子传递、三羧酸循环和氧化磷酸化产生能量的细胞器。同时也是氧化应激损伤的靶细胞器，是产生ROS的主要部位，线粒体功能受损时ROS显著增加。所以，OTA诱导氧化应激损伤可能在OTA诱发胃黏膜上皮细胞细胞周期阻滞的毒理学效应中起重要作用。为验证这一假设，本研究在前期实验的基础上选取人胃黏膜上皮细胞株GES-1，从氧化应激角度入手，首先观察OTA对GES-1细胞内ROS含量的影响，评价OTA诱导GES-1细胞DNA损伤的性质及特征，基于抗氧化策略的DNA损伤靶向干预揭示OTA诱导的氧化应激与DNA损伤和G2期阻滞的关系；接着研究OTA对GES-1细胞线粒体损伤的影响，探讨OTA诱导GES-1细胞ROS产生的分子机制。肿瘤的发生发展是多因素综合作用的结果，在肿瘤的发展、转移过程中免疫功能抑制发挥重要作用，免疫功能降低可能导致肿瘤发生几率增加。致癌性霉菌毒素诱发机体的免疫毒性作用与肿瘤的发生具有密切关系。为了进一步验证OTA诱发氧化应激损伤介导机体免疫细胞周期阻滞参与其免疫毒性作用，本研究选取人外周血单个核细胞（human peripheralblood mononuclear cells，hPBMC）作为研究对象，检测OTA对hPBMC细胞的氧化应激损伤作用和对细胞周期的影响及其可能分子机制。本研究拟从OTA作用靶细胞和机体免疫细胞两个方面揭示OTA诱导氧化应激损伤介导细胞周期阻滞的毒理学特性及其可能的分子机制，丰富和加深了人们对OTA生物效应的认识，为OTA暴露的合理处置提供分子位点，这将有助于全面评价OTA在胃癌发生、发展中的可能作用。第一部分赭曲霉毒素A诱导GES-1细胞氧化应激损伤介导G2期阻滞目的：探讨赭曲霉毒素A诱导人胃黏膜上皮细胞GES-1氧化应激损伤作用，及ATM和MAPK信号通路在氧化应激损伤介导GES-1细胞G2期阻滞中的调控作用。方法：1采用荧光探针DCFH-DA和DHE检测5、10、20μM OTA处理GES-1细胞24h后，细胞内ROS含量。2采用超氧化物歧化酶（SOD）测试盒检测OTA对GES-1细胞SOD活性的影响。3采用高效液相-电化学检测技术、免疫荧光技术和Western blot方法分析OTA处理后GES-1细胞DNA的损伤情况。4在以上研究的基础上给予抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸（NAC）4mM预处理1h，观察OTA处理对GES-1细胞ROS、SOD水平的影响及对DNA的损伤作用。5采用流式细胞术检测NAC预处理对OTA作用后细胞周期的影响。6采用Western blot方法检测NAC预处理对OTA作用后细胞周期关键调控分子Cdc25C、Cdc2和cyclinB1，信号通路ERK、p38MAPK、ATM蛋白表达及其磷酸化的变化情况。7采用免疫共沉淀技术检测NAC预处理对Cdc2-cyclinB1复合物形成的影响。结果： 1.1OTA对GES-1细胞ROS水平的影响流式细胞术检测结果显示，5、10、20μM OTA处理组DCF、DHE平均荧光强度均明显高于对照组（P0.05）；抗氧化剂NAC预处理1h，DCF、DHE平均荧光强度明显减低（P0.05）。结果提示，OTA诱导GES-1细胞ROS生成增多，NAC缓解了OTA的促ROS升高作用。 1.2OTA对GES-1细胞SOD活性的影响 SOD活性检测结果表明，GES-1细胞经OTA（5、10、20μM）处理24h，SOD活性分别为285.77±39.81、402.79±18.20、737.80±44.73U/mgprotein，显著高于对照组157.51±12.49U/mg protein（P0.05）；4mM NAC预处理+10μM OTA处理组SOD活性较单独10μM OTA处理组明显降低（202.35±10.51vs394.74±16.12U/mg protein，P0.05）。 1.3OTA对GES-1细胞DNA损伤的影响 8-OHdG为氧化应激损伤标志物。高效液相-电化学检测结果显示，不同浓度OTA作用GES-1细胞24h，8-OHdG含量明显较对照组升高（P0.05）。γ-H2AX为DNA双链断裂标志物，免疫荧光结果观察到OTA处理组GES-1细胞形成了典型的γ-H2AX焦点。Western blot结果显示，各个OTA处理组γ-H2AX蛋白表达上调（P0.05）。为了进一步明确ROS升高导致GES-1细胞DNA损伤，Western blot方法检测了NAC预处理后γ-H2AX蛋白的变化情况。结果显示，NAC+OTA处理组γ-H2AX蛋白表达水平明显低于OTA处理组（P0.05）。综合以上实验结果表明，OTA诱导GES-1细胞DNA发生氧化损伤。 1.4NAC预处理对OTA作用后ATM表达的影响为了进一步探讨ROS诱导GES-1细胞DNA损伤参与了OTA激活ATM激酶，我们给予抗氧化剂NAC清除ROS。Western blot检测结果显示，NAC预处理组ATM磷酸化水平明显低于单独OTA处理组（P0.05），ATM蛋白表达水平则明显高于OTA处理组（P0.05），说明抗氧化剂拮抗了OTA对GES-1细胞ATM激酶的激活作用。 1.5NAC预处理对OTA作用后ERK和p38MAPK信号通路的影响为了进一步明确ROS参与了OTA处理对ERK和p38信号通路的激活作用，给予抗氧化剂NAC预处理，应用Western blot方法检测了ERK、p38蛋白及其磷酸化水平的变化。结果显示，NAC预处理+OTA处理组ERK磷酸化水平和p38磷酸化水平显著低于OTA处理组（P0.05），提示NAC拮抗了OTA对GES-1细胞ERK和p38MAPK信号通路的激活作用。 1.6NAC预处理对OTA作用后GES-1细胞周期的影响为了进一步证明OTA诱导氧化应激损伤通过ATM和MAPK途径介导GES-1细胞发生G2期阻滞，在前面NAC拮抗了OTA对GES-1细胞ATM和MAPK（ERK和p38）通路激活的基础上，本研究在给予抗氧化剂NAC预处理后，观察了OTA对GES-1细胞周期及周期调控蛋白的影响。流式细胞术细胞周期检测结果显示，NAC预处理组G2/M期的细胞比例较10μM OTA处理组显著减少（P0.05）。结果提示NAC预处理可以部分逆转OTA诱导的GES-1细胞G2期阻滞。 Western blot结果显示，NAC预处理后，GES-1细胞Cdc25C、Cdc2和cyclinB1的蛋白表达水平及p-Cdc25C和p-Cdc2水平均较10μM OTA单独处理组明显升高（P0.05）。结果表明NAC缓解了OTA对的G2期关键调节因子（Cdc25C、Cdc2和cyclinB1）的抑制作用。实验结果揭示OTA诱导氧化应激损伤可能通过ATM和MAPK途径介导GES-1细胞发生G2期阻滞。第二部分赭曲霉毒素A对GES-1细胞线粒体的损伤作用目的：线粒体是产生ROS的重要细胞器，其损伤启动细胞的氧化应激损伤，本部分探讨OTA对GES-1细胞线粒体DNA、功能的影响。方法：1采用超氧化物歧化酶（SOD）分型测试盒检测5、10、20μMOTA处理24h，GES-1细胞MnSOD活力变化情况。2高效液相-电化学检测线粒体DNA（mtDNA）中8-OHdG含量的变化。3Real-time PCR检测mtDNA编码的呼吸链上的13个亚基（ND1，ND2，ND3，ND4，ND4L，ND5，ND6，COXⅠ，COXⅡ，COXⅢ，Cytb，ATP6，ATP8）mRNA水平变化情况。4采用线粒体呼吸链复合体I活性比色法定量检测试剂盒检测呼吸链复合体I活性。5采用Oxygraph-2k液相氧电极测定透膜细胞中线粒体氧耗速率。6罗丹明123染色，流式细胞术检测线粒体膜电位的变化。7Annexin V-FITC染色，，流式细胞术检测GES-1细胞凋亡情况。8Western blot检测MnSOD、碱基切除修复基因OGG1和凋亡因子Bax、Bcl-2、Bcl-xL、cytochrome c、caspase-9的表达情况。9给予GES-1细胞抗氧化剂4mM NAC预处理1h，检测OTA对GES-1细胞凋亡的影响。结果： 2.1OTA对GES-1细胞MnSOD的影响 MnSOD是线粒体中清除ROS的主要抗氧化酶。Western blot结果显示，各个OTA处理组MnSOD蛋白条带逐渐增强，明显高于对照组（P0.05）。MnSOD酶活性检测结果发现，5、10、20μM OTA处理组MnSOD活性分别为115.26±9.83，162.63±13.18和285.04±3.10U/mgprotein，显著高于对照组64.73±4.42U/mg protein（P0.05）。 2.2OTA对GES-1细胞mtDNA8-OHdG水平的影响应用高效液相-电化学检测技术检测8-OHdG，用以分析OTA对mtDNA的氧化损伤。结果显示OTA处理组8-OHdG水平明显较对照组升高（P0.05）。提示OTA诱导GES-1细胞mtDNA发生氧化损伤。 2.3OTA对GES-1细胞线粒体中OGG1蛋白水平表达的影响 Western blot结果显示，OTA5、10、20μM处理组线粒体中OGG1蛋白条带较对照组显著减弱（P0.05）。结果提示，OTA抑制线粒体碱基切除修复途径。 2.4OTA对线粒体基因表达的影响 Real-time PCR检测了线粒体DNA编码的氧化呼吸链复合体的13个亚基mRNA水平的变化。5、10μM OTA处理组各亚基mRNA水平无明显变化（0.5＜Fold change＜1.5）；20μM OTA处理组复合体I亚基ND1、ND2、ND3、ND4L、ND5和ND6mRNA表达水平较对照组明显升高（Foldchange＞1.5），ND4mRNA变化不明显；复合体III亚基cytb和复合体IV亚基COXI、COXII、COXIII mRNA无明显变化（0.5＜Fold change＜1.5）；复合体V亚基ATP6mRNA水平明显升高（Fold change＞1.5），ATP8mRNA水平无明显变化（0.5＜Fold change＜1.5）。 2.5OTA对线粒体呼吸链复合体I活性的影响 Real-time PCR检测发现OTA主要诱导呼吸链复合体I亚基mRNA表达升高，为了进一步明确OTA对复合体I的影响，对其活性进行了检测。结果发现各OTA处理组（5、10、20μM）复合体I活性均明显低于对照组（P0.05），提示OTA抑制了线粒体呼吸链复合体I活性。 2.6OTA对线粒体呼吸的影响检测结果发现，5、10、20μM OTA处理组线粒体ST3呼吸速率均较对照组显著降低（P0.05）；ST4呼吸速率无明显变化；10和20μM OTA处理组呼吸控制比（RCR）与对照组相比明显降低（P0.05），提示OTA抑制了GES-1细胞线粒体呼吸功能。 2.7OTA对GES-1细胞凋亡的影响因为线粒体损伤后会启动线粒体途径介导细胞凋亡，本实验进一步验证OTA致线粒体损伤诱导细胞氧化应激损伤导致细胞通过线粒体途径凋亡。 2.7.1OTA对线粒体膜电位（ΔΨm）的影响线粒体膜电位降低是线粒体功能障碍的特点，是细胞凋亡的早期事件之一。流式细胞术检测结果显示，与对照组相比，OTA处理明显减低了罗丹明123的平均荧光强度（P0.05）。为了探讨ROS是否参与了ΔΨm的变化，抗氧化剂NAC预处理细胞1h再给予10μM OTA孵育24h，罗丹明123平均荧光强度较单独10μM OTA处理组明显升高（P0.05）。提示OTA诱导ROS生成增加介导了GES-1细胞线粒体膜电位降低。 2.7.2NAC对OTA诱导GES-1细胞凋亡的影响为了进一步明确OTA通过氧化应激诱导GES-1细胞凋亡，实验采用抗氧化剂NAC预处理来减少ROS。Annexin V-PI双染法检测结果显示，10μM OTA处理组细胞凋亡率为12.67±2.12%，明显高于对照组3.03±0.77%；4mM NAC+10μM OTA处理组细胞凋亡率为5.56±1.80%，较10μM OTA处理组显著降低（P0.05）。 2.7.3OTA对凋亡相关蛋白的影响为了研究线粒体途径是否参与了OTA诱导的GES-1细胞凋亡，我们首先检测了促凋亡基因Bax和抑凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL的蛋白水平变化。Western blot检测结果显示，OTA处理增加了Bax蛋白水平；相反，降低了Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达量（P0.05）。NAC预处理1h， NAC+OTA处理组Bax蛋白表达较相应的OTA处理组明显降低，而Bcl-2和Bcl-xL的蛋白表达明显升高（P0.05）。 Cytochrome c从线粒体释放到细胞胞浆是线粒体凋亡途径级联反应的一个关键步骤，激活下游的caspase。Western blot分别检测了线粒体部分和胞浆部分cytochrome c的蛋白变化情况。OTA暴露24h，线粒体中cytochrome c蛋白表达量明显减少；同时，胞浆中cytochrome c表达量明显增加（P0.05）。NAC抗氧化剂预处理后，和相应的单独OTA处理组相比，NAC+OTA处理组线粒体部分cytochrome c蛋白表达量明显升高，胞浆部分明显减少（P0.05）。释放到胞浆的cytochrome c激活caspase-9。各种浓度OTA处理GES-1细胞后，非活性procaspase-9蛋白表达降低，而活性形式表达增强（P0.05）。NAC明显逆转了OTA对caspase-9的激活作用（P0.05）。综合以上实验结果，提示OTA通过氧化应激激活线粒体途径介导GES-1细胞凋亡。第三部分赭曲霉毒素A诱导人外周血单个核细胞DNA氧化损伤及其介导G1期阻滞目的：探讨OTA对人外周血单个核细胞（hPBMC）的氧化应激损伤作用及其毒理学效应。方法：1采用荧光探针DCFH-DA和DHE，应用流式细胞术检测OTA（5，10，20μM）处理24h对hPBMC细胞ROS含量的影响。2采用谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒检测hPBMC细胞内GSH水平的变化。3采用高效液相-电化学方法、碱性彗星实验及Western blot技术检测hPBMC细胞DNA的损伤情况。3采用流式细胞术检测OTA对hPBMC细胞周期的影响。4采用Western blot方法检测OTA作用后细胞周期关键调控分子CDK4和cyclinD1在蛋白水平的表达变化。5应用流式细胞术、Hoechst33258荧光染色分析OTA对hPBMC细胞凋亡的影响。6给予抗氧化剂NAC预处理后重复上述实验，探讨氧化应激参与了OTA的生物效应。结果： 3.1OTA对hPBMC细胞ROS的影响流式细胞术结果显示，5、10、20μM OTA处理24h后，DCF和DHE的平均荧光强度均明显增加（P0.05）。给予4mM NAC预处理1h，20μMOTA+4mM NAC处理组DCF的平均荧光强度显著低于20μM OTA单独处理组；DHE的平均荧光强度较OTA单独处理组也显著降低（P0.05）。提示OTA处理可以诱导ROS生成增加，此作用可以被抗氧化剂NAC缓解。 3.2OTA对hPBMC细胞内GSH含量的影响给予不同浓度OTA处理24h后，hPBMC细胞内GSH含量明显较对照组降低（P0.05）。NAC预处理组GSH水平较OTA处理组明显升高（P0.05）。因为NAC是巯基化合物，既可以直接清除自由基，又能参与还原型谷胱甘肽的合成，本实验提示NAC可以保护hPBMC细胞，防止OTA导致GSH含量降低，进一步证明OTA对hPBMC的氧化应激作用。 3.3OTA对hPBMC细胞DNA损伤的影响高效液相-电化学检测结果显示，各种浓度OTA处理组中8-OHdG的水平明显高于对照组（P0.05）。荧光显微镜下观察碱性彗星实验结果发现，OTA处理组细胞电泳后出现了“彗星”现象，彗星拖尾明显；20μM OTA+4mM NAC处理组细胞彗星尾部小于OTA处理组。统计分析发现，与对照组相比，各处理组hPBMC细胞彗星的Tail DNA%、Tail Length及Olive Tail Moment值均明显高于溶剂对照组（P0.05）。抗氧化剂NAC预处理1h，上述指标均显著降低（P0.05）。 Western blot结果显示，5、10、20μM OTA处理组γ-H2AX蛋白表达明显增加（P0.05）。NAC预处理明显下调γ-H2AX表达（P0.05）。上述结果表明OTA诱导hPBMC细胞DNA发生氧化损伤。 3.4OTA对hPBMC细胞周期的影响流式细胞术检测结果发现，10、20μM OTA处理组G1期细胞比例分别为52.27±3.00%、52.67±1.45%，显著高于对照组31.03±7.88%（P0.05）。NAC预处理后，NAC+OTA处理组G1期细胞比例较OTA处理组显著降低（37.07±2.48%vs48.30±2.07%，P0.05）。 Western blot结果显示，OTA处理可以降低hPBMC细胞cyclinD1和CDK4蛋白表达（P0.05）。4mM NAC预处理+20μM OTA处理组cyclinD1和CDK4蛋白表达均较单独20μM OTA处理组明显提高（P0.05）。综合实验结果表明OTA诱导hPBMC细胞发生G1期阻滞，抑制cyclinD1和CDK4蛋白表达；NAC可以逆转OTA对cyclinD1和CDK4蛋白表达的抑制作用，从而缓解G1期阻滞。 3.5OTA对hPBMC细胞凋亡的影响流式细胞术细胞周期检测结果显示，hPBMC细胞经5、10、20μM OTA处理24h后，OTA各处理组细胞凋亡率分别为5.99±1.54%、7.07±1.30%和11.84±1.51%，均高于溶剂对照组3.77±0.38%（P0.05）。NAC预处理，部分缓解了OTA的促凋亡作用（7.12±0.94%vs17.81±1.23%，P0.05）。荧光显微镜下观察Hoechst33258荧光染色法凋亡细胞形态学改变，20μM OTA作用24h后，hPBMC细胞胞核出现核固缩、碎裂，产生凋亡小体，NAC预处理组没有观察到明显的细胞核改变。结果提示，OTA诱导细胞氧化应激损伤介导对hPBMC的促凋亡作用。结论： 1OTA可以诱导GES-1细胞发生氧化应激损伤。 2OTA诱导细胞氧化应激损伤通过ATM和MAPK通路参与其诱导GES-1细胞G2期阻滞的发生。 3OTA诱导GES-1细胞线粒体DNA损伤，抑制碱基切除修复功能，呼吸功能降低；这可能是GES-1细胞ROS水平升高、发生氧化应激损伤的重要原因。 4OTA激活线粒体途径诱导GES-1细胞发生凋亡。 5OTA可以诱导hPBMC细胞ROS生成增多，发生DNA氧化损伤，进而介导hPBMC细胞G1期阻滞和凋亡。这可能参与了OTA的免疫抑制生物效应。 6OTA通过诱发氧化应激损伤作用介导胃组织靶细胞和机体免疫细胞细胞周期阻滞和凋亡，这一毒理学效应可能与OTA参与胃癌的发生、发展具有密切关系。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R735.2;R155.5

【参考文献】