三聚氰胺及三聚氰酸的体内外生物学效应研究

发布时间：2019-10-29 23:15

【摘要】：背景：三聚氰胺，又称为蛋白精，是一种有机化合物，在许多制品中被广泛用作有机化学中间体。目前，它最重要的作用是作为三聚氰胺树脂的原材料。另外，三聚氰胺在建筑材料、灭火剂、纺织业、皮革制品、造纸业及其它工业中也被使用。此外，它还可以用来合成药物或作为其载体分子。三聚氰胺有一定的毒性，本不应该在食品中出现，但却相继出现了几起三聚氰胺食品污染事件。例如，2007年在美国发生的宠物食品污染；2008年中国的毒奶粉事件导致29万儿童患病，其中6人因为尿道和肾脏的并发症而死亡，这是一起非常严重的中毒事件，引起了全世界的关注。此次认为婴儿的肾脏衰竭是由食物中的三聚氰胺及其衍生物所致。但是目前对这种化合物单独或协同作用还不是完全清楚。而当国家食品药品监督管理局发布了当时对中国市场乳制品检测结果时，更造成了人们对乳产品的恐慌，对中国乳制品产业造成了重创。美国FDA在发表有关三聚氰胺限量值的报告时同时指出，“根据目前的研究，还无法对婴儿奶粉建立一个他们认为不会引起健康顾虑的三聚氰胺标准，我们对三聚氰胺了解得太少了”。可见科学深入地理解三聚氰胺的生物学和毒理学效应,不仅是研究需要,更是社会稳定的必要。然而目前并没有详细的或非常系统的报告，因为现已发表的关于三聚氰胺的文献跨越了不同的研究目的。目的：虽然人们对三聚氰胺的性质了解很多，但是仍然还存在一些盲点：三聚氰胺导致肾结石的发病机制并没有完全研究清楚；三聚氰胺及其同系物的协同效应也没有充分的解释。因此，本研究旨在确定三聚氰胺和它的同系物（三聚氰酸）在体外细胞培养中的毒性作用及细胞水平的半数致死量。然后根据体外的研究，观察在wistar大鼠各个器官中这两种物质单独及协同作用的毒性，确定这些物质除了对肾脏及泌尿系统相关的器官产生毒性外，还对其他组织产生的影响。方法：本研究首先使用MTT比色，在体外培养的NRK-52E和293T细胞系中加入不同浓度的三聚氰胺或三聚氰酸，检测细胞细胞增殖活性，计算三聚氰胺和三聚氰酸对这两种细胞的半数致死量。随后根据三聚氰胺和三聚氰酸的细胞毒性进行动物体内实验。实验动物采1月龄wistar大鼠，随机分为四组，每组四只（雌雄各半），对各组动物进行4周灌胃处理，每日1次。第1组：3mL生理盐水灌胃；第2组：3mL三聚氰胺灌胃（180mg/Kgbwt.）；第3组：3mL三聚氰酸（150mg/Kg bwt.）灌胃；第4组：1.5mL三聚氰胺（180mg/Kg bwt.）+1.5mL三聚氰酸（150mg/Kg bwt.）灌胃。1个月后，将各组实验动物处死、称重，切除大鼠的肾脏、膀胱、肝脏、胃、心脏、脾脏、卵巢、子宫及睾丸并称重。将各器官分三份，其中一份于4%多聚甲醛中固定，以备做组织学实验；另两份于-80°冰箱冷冻保存，，以备做酶联免疫吸附实验（ELISA）及高效液相-质谱（HPLC-MS）实验。通过组织切片及苏木精-伊红染色，观察在三聚氰胺及三聚氰酸影响下组织器官的病理改变；间接竞争性抑制ELISA及HPLC-MS法确立三聚氰胺在各器官的分布，最终得到的大鼠器官三聚氰胺的浓度用ng/g来表达。结果： 1．三聚氰胺和三聚氰酸的细胞毒性研究表明，三聚氰胺对NRK-52E细胞半数致死量是1.89mg/mL，对293T细胞2.07mg/mL；而三聚氰酸对NRK-52E细胞半数致死量是4.20mg/mL，对293T细胞是3.70mg/mL。 2．组织学研究表明，三聚氰胺-三聚氰酸联合灌胃组肾脏的髓质、皮质区域产生土黄色的结晶，胃壁的主细胞缺失。三聚氰胺和三聚氰酸单独灌胃组各器官无明显形态学改变。 3．组织匀浆液ELISA检测结果表明，肾、胃、子宫和睾丸的组织匀浆中，4组三聚氰胺含量为57.30±4.44ng/g，63.02±7.10ng/g，55.23±6.27ng/g和59.23±4.60ng/g，三聚氰酸的含量为59.79±5.24ng/g，58.44±1.58ng/g,56.74±1.29ng/g和64.14±1.10ng/g。 4．组织匀浆液HPLC-MS检测结果表明：三聚氰胺组、三聚氰酸组及联合灌胃组中各器官三聚氰胺含量均高于生理盐水组，其中三聚氰胺-三聚氰酸联合灌胃组肾脏三聚氰胺含量最高(296ng/g)，三聚氰胺组中肾脏受累最明显（11.83ng/g），其次分别是子宫(9.6ng/g)和肝脏(6.8ng/g)。结论： 1.组织学研究及HPLC-MS实验结果表明，三聚氰胺与三聚氰酸联合作用将形成网格状的大型复合物，其毒性远强于三聚氰胺与三聚氰酸单独作用，肾脏是主要的受累器官。 2． HPLC-MS检测结果表明，三聚氰胺不仅对肾脏有影响，在子宫和肝脏也会有大量的沉积。 3.细胞学实验结果表明，三聚氰胺与其同类物三聚氰酸相比毒性更强，然而它们分别低剂量作用时毒性低。 4.酶联免疫吸附法在检测组织中三聚氰胺及其类似物的含量时是不可靠不灵敏的，高效液相色谱-质谱联用法是较佳选择。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

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