抗阪崎肠杆菌LPS单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

发布时间：2019-11-21 00:24

【摘要】：阪崎肠杆菌（Enterobactorsakazakii，ES）是一种严重危害婴幼儿健康的食源性病原菌，在环境中广泛存在。该菌感染婴幼儿可引起新生儿严重的败血症、脑膜炎以及坏死性结肠炎，，因此快速、简便、灵敏的检测方法是预防和控制该菌感染的关键。本研究制备了ES脂多糖（LPS）及其单克隆抗体，对其生物学活性进行了分析，并且建立了检测ES菌体的双抗体夹心ELISA方法，为该菌的防控、免疫学检测以及致病机理的进一步研究奠定了基础。保存条件不同的ES菌体，分别采用热酚水法和冷酚水法提取3种ESLPS抗原，同时收集水相和酚相的LPS，并对其纯度、产率、免疫反应性等特性进行比较分析。3种LPS产率分别为6.21%、13.09%、7.57%；3种LPS多糖含量分别为7.26%、16.54%、5.91%，蛋白含量均小于0.5%，分子量均分布在14.4~45.0KD之间。用制备的抗原加强免疫小鼠，与对照组相比在短时间内试验组小鼠的血清抗体效价可从1:8000提高至1:12000。用热灭活的ESATCC51329菌体抗原对BALB/c小鼠进行基础免疫，融合前3天用LPS抗原及菌体抗原联合加强免疫。采用50%聚乙二醇2000将小鼠脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合。以ES菌体结合LPS作为筛选抗原建立间接ELISA筛选方法。采用有限稀释法对阳性孔进行3~4次亚克隆，最终共获得9株可稳定分泌ES-LPS单克隆抗体的杂交瘤细胞。其中1A11、2A7、4B10三株是针对ES-LPS核心多糖，其免疫球蛋白亚类分别为IgG1、IgG3和IgG3。采用体内腹水诱生法制备单克隆抗体，并将收集的腹水经饱和硫酸铵沉淀和SephacryL-300进行纯化。用ELISA法检测腹水和细胞上清效价，三株单抗的腹水效价可达1:104~105，1A11的细胞上清效价为1:2560，2A7和4B10为1:1280。分析3株单抗的抗原位点，结果表明3株单抗针对不同的抗原位点。SDS-PAGE表明3株单抗重链分子量约为50KD，轻链分子量约为25KD。稳定性试验结果表明3株细胞在克隆化过程中细胞上清OD450总体呈上升趋势，传代腹水效价均可达1:104，具有较好的稳定性。特异性结果显示：除单抗2A7、4B10纯化的腹水抗体与大肠杆菌存在微弱交叉反应外，其余15株受试菌株均与三株单抗不发生交叉反应取单克隆抗体1A11，经改良过碘酸钠法制备成辣根过氧化物酶（HRP）酶标抗体，即1A11-HRP。以单克隆抗体2A7为捕获抗体、1A11-HRP为检测抗体建立ES双抗体夹心ELISA检测方法。该方法对C.Muytjensii属的ESATCC51329菌体具有特异性，但与受试的Cronobacter sakazakii(如:ATCC29544，ATCC12868)属菌株没有交叉反应，该方法对纯培养液的检测限在103~105cfu/ml，即每孔100~10000cfu。本方法可用于对ESC.Muytjensii属细菌的检测，并有望与其他检测方法结合用于对ES的检测。
【图文】：

不连续光谱,阶梯,光谱

图 2 -1 不连续光谱扫描结果 Fi g . 2 -1 R e s u lt o f s p e c tr u m s c a n ni n g2. 2. 4 相对分子质量 S DS -P A G E 银染结果显示， 3 种 LP S 的相对分子质量差异不大，均分布在14 .4 ~ 4 5 . 0K D 之间，且呈现典型的阶梯状电泳条带。 3 种不同提取物的酚相和水

抗阪崎肠杆菌LPS单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA方法的建立

纯化LPS的SDS-PAGE分析
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R155.5

【参考文献】