蛋白质芯片技术定量检测牛乳中β-乳球蛋白与乳铁蛋白的检测平台的建立

发布时间：2019-11-27 21:19

【摘要】：目的:优化蛋白质芯片技术同时定量检测牛乳中β-Lg和Lf的检测条件,建立相应的检测方法,并对此检测方法的应用进行评价。方法:基于双抗体夹心法检测抗原的原理,利用蛋白芯片对所选的β-Lg抗体、抗原和Lf抗体、抗原进行鼠单克隆抗体的筛选、探针种类的选择、固定探针浓度与检测抗体浓度组合、点样一致性确定、封闭剂种类优化、生物检测限与检测下限、S型曲线的建立与线性范围的判断、标准曲线与回归方程的建立等实验研究,优化并确定了蛋白芯片技术同时检测牛乳β-Lg与Lf的检测条件。在检测条件确定的基础上对同时定量检测两种目标蛋白的蛋白芯片技术的准确度、精密度、方法学对照及检测时效进行研究和评价。结果:鼠单克隆抗体筛选实验结果证明所选β-Lg抗原、Lf抗原在芯片上能与各自相应的抗体结合,而β-Lg鼠单克隆抗体66#和Lf鼠单克隆抗体75#特异性最好。点样探针优化实验证明β-Lg、Lf两种蛋白的鼠单抗为固定探针时结果优于兔多抗为探针时的结果。β-Lg固定探针与检测抗体的浓度组合为:β-Lg鼠单克隆抗体66#的固定浓度为0.5 mg/mL,β-Lg兔多抗的检测效价为1:2000;Lf固定探针与检测抗体的浓度组合为:Lf鼠单克隆抗体75#的固定浓度为0.5 mg/mL,Lf兔多抗的检测效价为1:2000。点样一致性实验显示:为同时保证β-Lg鼠单克隆抗体66#和Lf鼠单克隆抗体75#两种抗体理想的点样效果,点制芯片时每次取样后必须预点46点,同时预点后的点样数应控制在44个点以内。选择1%WB无蛋白封闭液作为封闭剂。β-Lg生物检测限为33.52 ng/mL、检测下限为5.41 ng/mL,Lf生物检测限为3.60 ng/mL、检测下限为0.96 ng/mL。β-Lg抗原浓度在134.06-4290.00 ng/mL范围内与检测信号值成线性关系,Lf抗原浓度在14.40-460.75 ng/mL范围内与检测信号值成线性关系,在线性范围内选择五点建立同时检测两种蛋白的标准曲线。β-Lg稀释回收率在50.4%-112.7%之间、加标回收率在86%-107%之间,Lf稀释回收率在106.5%-144.8%之间、加标回收率在83.7%-128.5%之间。蛋白芯片法同时检测β-Lg和Lf的结果与ELISA法对两种目标蛋白分别进行检测的结果间无统计学差异,两种方法检测β-Lg和Lf的相关系数分别为0.743和0.773,并且相关系数具有统计学意义。β-Lg批内变异系数在7.6%-11.6%之间、批间变异系数在14.9%-33.5%之间,Lf批内变异系数在4.9%-14.2%之间、批间变异系数在24.8%-38.3%之间。完成抗原抗体反应后10天之内,蛋白芯片检测样品浓度之间无统计学差异。结论:优化了用于牛乳β-Lg和Lf检测的蛋白芯片检测条件,从而建立了同时定量检测牛乳β-Lg和Lf的蛋白芯片平台。
【图文】：

中国疾病预防控制中心营养与健康所硕士学位论文表１－３三株Ｌｆ鼠单抗与Ｌｆ结合的信号值比较逡逑Ｔａｂｌｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｖａｌｕｅ邋ｏｆ邋ｔｈｒｅｅ邋Ｌｆ邋ｍｏｕｓｅ邋ｍｏｎｏｃｌｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ邋ｒｅａｃｔｉｎｇ邋ｗｉｔｈ邋Ｌｆ邋（ｎ＝３，邋ｘ邋±邋Ｓ＇）逡逑组别逦Ｌｆ鼠单抗１＃逦Ｌｆ鼠单抗３５＃逦Ｌｆ鼠单抗７５＃Ｌｆ邋高抗原逦５７７６９±３０逦５２６０６±９０１３逦５７６７６邋土邋２９逡逑Ｌｆ邋低抗原逦６４０９７±３５逦３３５９５±６６５２逦３６３７５±４４７阴性对照组逦３５３７±４８３邋ｕ’２）逦８８０±５１５逦６３４±１６８注：（１）与Ｌｆ鼠单抗３５＃比较，尸＜０．邋０５；邋（２）与Ｌｆ鼠单抗７５＃比较，尸＜０．邋０

从两种鼠单抗的点样一致性扫描图和点样一致性分析图中可以看出：点样数逡逑在第４４？第９２点之间，（Ｂ邋－Ｌｇ鼠单抗６６＃的点样效果趋于一致。在第４３点和第逡逑９３点，（３邋－Ｌｇ鼠单抗６６＃的信号强度均出现陡降（图１－３、图１－５）。但对于Ｌｆ逡逑鼠单抗７５＃来说，点样数在第４７？第９０点之间，Ｌｆ鼠单抗７５＃的点样效果趋于逡逑一致。在第４６点和第９１点，Ｌｆ鼠单抗７５＃的信号强度均出现陡降（图１－４、逡逑图邋１－５）。逡逑因此，为同时保证（３邋－Ｌｇ鼠单抗６６＃和Ｌｆ鼠单抗７５＃两种抗体理想的点样效逡逑果，，点制芯片时必须预点４６点，同时应保证单次沾样后的点样数应控制在４４逡逑个点以内。逡逑图１－３邋（Ｊ－Ｌｇ鼠单抗６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）点样一致性扫描图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－３邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｈｏｍｏｇｅｎｅｉｔｙ邋ｏｆ邋ｄｉｅ邋ｓｐｏｔ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｂｅ邋ｏｆ邋Ｐ－Ｌｇ邋６６＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）逡逑—Ｂ逡逑图１－４邋Ｌｆ鼠单抗７５＃邋（０．５邋ｍｇ／ｍＬ）点样一致性扫描图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－４邋Ｔｈｅ邋ｉｍａｇ
【学位授予单位】：中国疾病预防控制中心
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R155.5

【参考文献】

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本文编号：2566771