苯并芘诱导HeLa细胞DNA损伤的核蛋白组学分析

发布时间：2020-01-21 17:30

【摘要】：[背景] 多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)来源广泛,主要是由于有机物的不完全燃烧所致,如垃圾焚烧、汽车尾气、熏制食品等,是一类重要的环境和食品污染物。多环芳烃能够引起人体发生炎症反应、免疫系统功能下降、动脉粥样硬化、癌症等,严重地威胁着人类的健康。作为最具代表性的多环芳烃,苯并芘(benzo(a)pyrene, BaP)具有很强的致癌毒性,常被作为研究多环芳烃致癌的模式药物。它的致癌机制主要被认为是其活化代谢产物(BPDE)与DNA共价结合形成DNA加合物[5]。一旦DNA的损伤得不到及时的修复时,就会在复制过程中造成基因突变或染色体畸变,最终促发癌症的产生。目前,有大量的研究深入探讨BaP诱导DNA损伤应答的机制,并证实了许多与DNA损伤应答相关的蛋白,为更好地了解BaP致癌的机理提供了重要的依据。 然而,这些研究大都集中于全细胞蛋白组学的研究,这往往会导致一些低丰度的蛋白被忽视,如一些细胞核内的蛋白,它们在调控致畸、致癌等细胞程序上起到极为重要的作用。因此,使用亚细胞分离法或细胞器官蛋白组学的方法来分析蛋白(含低丰度蛋白)表达的改变就显得尤为重要。另一方面,考虑到DNA损伤应答起始于细胞核内,会引起大量的核蛋白表达发生改变,因而,在本次研究中我们主要观察不同浓度的BaP诱导HeLa细胞后,其核蛋白改变的情况。 [目的] 为了更深入的了解BaP诱导的DNA损伤应答,发现可能的新机制,我们采用高通量技术(双向电泳、质谱)全面了解BaP对HeLa细胞核蛋白表达的影响,鉴定并验证BaP调控的相关蛋白,从而更深入的了解BaP诱导DNA损伤应答的过程,为DNA损伤应答及BaP诱导的癌症机理提供科学依据。 [方法] 1.不同浓度(0.1μM、1μM、10μM)的BaP处理HeLa细胞6h后,提取细胞核蛋白,并用Bradford法进行蛋白定量 2.双向电泳及质谱鉴定 3.对成功鉴定的蛋白进行查库(Swiss-Prot数据库),并按功能对其进行分类 4.采用siRNA干扰、Western Blot等技术对部分鉴定的蛋白的功能进行验证 [结果] 1、不同浓度的BaP处理HeLa细胞后,通过对比双向电泳结果发现：与对照组相比,实验组中125个蛋白点有明显差异(79个点下调,46个点上调)。最终经质谱成功鉴定出39个蛋白。Western blot验证部分蛋白(ANXA1和NF-κB),其结果与双向结果一致。 2、采用siRNA干扰技术将ANXA1蛋白表达干扰后,BaP诱导的DNA损伤明显增加(γH2AX焦点明显增多)；但对细胞凋亡的影响不大。 3、P28GANK表达的下降引起NF-κB在细胞核中的表达增加,同时在胞浆中的量减少。 [结论] 1.BaP处理可导致细胞核蛋白的表达的改变。 2. ANXA1可降低BaP诱导的DNA损伤程度,起到保护的作用。 3. NF-κB通路可能参与BaP诱导DNA损伤应答。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R114

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本文编号：2571668