基于适配体散射探针、CSDPR的食源性致病菌快速检测

发布时间：2020-02-02 10:52

【摘要】：在全球化背景下,由食源性致病菌引起的疾病呈现高发态势,严重威胁人们的健康,阻碍社会经济的发展,成为全球共同关注的问题。食品在生产加工、运输贮存以及销售等各个环节都可能受到细菌的污染,而且食品工业门类多、产量大、流通广,所以需要快速有效、成本友好、设计简单的细菌检测手段来确保食品过程的安全。随着核酸研究的不断发展,具有特异性识别能力的功能核酸,尤其是核酸适配体和分子信标,因其方便合成、易于修饰、稳定性好、特异性高等特点在食品安全领域展现出巨大的应用潜力。本论文分别基于核酸适配体对菌细胞表面特殊位点的识别和分子信标对细菌特异性核酸的识别构建了两种不同的食源性致病菌快速检测方法。(1)以36XC学生显微镜为基础,自制套筒式连接器安装暗场聚光镜,自制高度调节指针指示焦点高度,将36XC显微镜改造成便携式暗场显微镜作为检测设备。采用柠檬酸三钠还原法合成粒径60 nm的金纳米颗粒,并用紫外可见光谱仪和透射电子显微镜表征。将修饰核酸适配体的金纳米颗粒作为识别目标和报告信号的功能化散射探针。使用透射电子显微镜表征散射探针对目标的结合能力,发现细菌表面的完整性是细菌能和适配体结合的必要条件,证明功能化金纳米颗粒散射探针检测的是金黄色葡萄球菌活菌。暗场镜检采用10倍物镜,分为直接暗场镜检和间接暗场镜检。直接暗场镜检通过观察聚集在目标表面的散射探针发出的葡萄串状分布散射光点来实现对金黄色葡萄球菌的可视化识别;间接暗场镜检的第一步是过滤洗去未结合的功能化金纳米探针,再将细菌表面结合的散射探针洗脱分离并对分离出的金纳米颗粒进行暗场镜检,通过多步特异性分离的方法检验目标物的存在。对不同浓度的金黄色葡萄球菌分别采取间接暗场镜检法进行定性的检测分析,结果显示对金黄色葡萄球菌的阳性判定检测限为4.6×10~6CFU/m L。通过将分离步骤中使用的水系针式过滤器替换为核酸纯化柱,优化了过滤洗涤和洗脱的操作,将方法的检测限降低为2.9×10~3 CFU/m L,实现三个数量级的灵敏度改进,而且通过简单的前处理即可实现实际牛奶样品中金黄色葡萄球菌的检测。(2)基于循环链置换聚合酶反应(CSDPR)原理,以金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、肠出血性大肠埃希氏菌(EHEC)和志贺氏菌为目标细菌,选取目标细菌特异性的基因区间设计分子信标荧光探针和循环引物,建立CSDPR反应体系。通过优化实验确定分子信标荧光探针茎结构的最佳长度为8 nt;探针和引物的最佳浓度均为200 nmol/L。针对以上四种目标菌,以非致病性大肠埃希氏菌、表皮葡萄球菌、白色葡萄球菌等额外六种细菌为对照菌,探究CSDPR检测方法下探针的特异性,结果显示金黄色葡萄球菌探针能够精确鉴定到相应的菌种(species),EHEC探针能够特异性鉴定EHEC,沙门氏菌和志贺氏菌探针则能鉴定到相应的菌属(genus)。以各稀释梯度的四种目标菌基因组DNA为模板,进行CSDPR扩增反应,建立定量CSDPR模型,实现对目标细菌的定量检测。其中,对金黄色葡萄球菌的定量分析线性范围为2×10~5~2.5×10~6 CFU/m L,检测限为9.5×10~4 CFU/m L;对沙门氏菌、EHEC、志贺氏菌的定量分析线性范围为1.0×10~4~1.0×10~6 CFU/m L,检测限分别为4.8×10~4 CFU/m L、3.4×10~4 CFU/m L、3.0×10~4CFU/m L。以金黄色葡萄球菌为目标菌,人工添加低浓度(9.2×10~1 CFU/m L、9.2×10~2CFU/m L、9.2×10~3 CFU/m L)的金黄色葡萄球菌至牛排、牛奶样品中进行增菌培养,分别于4 h、6 h、8 h、10 h、12 h五个时间点对菌液进行平板计数和定量CSDPR检测,并比较平板计数和定量分析的结果。结果显示通过最短6 h的增菌培养即可检出国标限量浓度下的金黄色葡萄球菌;在牛排样品和牛奶样品中金黄色葡萄球菌的平板计数结果和CSDPR定量检测结果的平均相对误差分别为14.5%和11.4%。
【图文】：

暗场显微镜,实物,结构示意图,连接器

第二章适配体功能化金纳米散射探针检测金黄色葡萄球菌光镜相连后，通过接件外侧自锁性较好的三角形螺纹同螺帽式接件连接。因为螺帽式接件上端具有和载物台中央螺旋接口吻合的三角螺纹，所以套筒式连接器可以整体连接在载物台下。通过转动螺栓式接件，可以调整暗场聚光镜的高度，使其与载物台上表面吻合，也可以辅助调节焦点高度。改装后的暗场显微镜，既可以直接用肉眼通过目镜观察，也可以使用 CCD 接口连接的相机进行观察和拍摄。为了便于在样品观察时进行快速聚焦调节，，在图 2-1（c）和（d）中圈出的位置标上记号，用一片通过强力胶粘在载物台边缘的载玻片作为高度指针。在使用 10 倍物镜观察时，调节粗准焦螺旋至高度指针上表面与圆圈处标记持平，此时目镜中观察到的即为载玻片的上表面（盖玻片的下表面）处的待观测物，继续调节细准焦螺旋即可看清样品。这个微小的设计可以有效缩短焦距调节时间，也可以避免错误对焦（比如焦点对准的是载玻片下表面）引起的错误观察。

透射电镜,金纳米颗粒,紫外可见吸收光谱,透射电镜

江南大学硕士学位论文纳米颗粒的表征外可见吸收光谱对前面合成的金纳米颗粒进行表征后得到如图 2-2（a）所光谱中有一个单一吸收峰出现在 532 nm 附近，峰宽较窄，证明金纳米颗径大小较为接近，可以作为良好载体进行核酸适配体修饰。根据 Haiss 等米粒径与紫外可见吸收峰的关系可以得出当峰值在 532 nm 时，其粒径大。图 2-2（b）是金纳米颗粒的透射电镜图，由图可知，金纳米颗粒的粒径分散性较好，粒径分布较为均一，符合预期，也与紫外可见吸收光谱图的
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R155.3

【参考文献】