【摘要】：肠道菌群在维持机体的健康过程中发挥着重要的作用,与人体的消化营养、免疫代谢、生物拮抗等密切相关。但是近年来,抗生素的过度使用导致了肠道菌群的紊乱,对机体的健康产生了较大的影响,而如何改善由抗生素引起的肠道菌群紊乱成为了研究热点。乳酸菌是人体肠道中重要的有益菌,可以通过抑制致病菌的繁殖来调节肠道菌群紊乱,达到改善肠道微环境的效果。本文利用分离筛选出的具有益生功能的乳酸菌,研究其混合发酵乳在体外抑制肠道致病菌的能力,通过Illumina高通量测序技术探讨混合乳酸菌发酵乳对抗生素诱导的小鼠肠道菌群失衡的调节作用。主要研究内容如下:(1)从广西巴马长寿人群粪便和云南新疆传统发酵乳制品中分离乳酸菌,并研究其耐酸耐胆盐能力、黏附细胞能力、抑菌能力及耐药特性。结果表明,45株乳酸菌中,菌株J、La、Xn及Yd 4株乳酸菌的耐酸耐胆盐能力较高,在pH为3.0的人工模拟胃液中培养3h存活率分别为43.38%、65.89%、20.32%、57.75%,在胆盐浓度为0.30%的培养基中培养24h的存活率分别为45.96%、53.33%、22.33%、31.05%;4株乳酸菌对细胞IEC-6的黏附率均大于8个/cell;对大肠杆菌、沙门氏菌及艰难梭菌3种肠道病原菌的抑制能力均为高度抑菌,抑菌圈直径均大于20mm;经生理生化及16SrRNA鉴定,菌株Xn为发酵乳杆菌(Lactobacilusfermentum),菌株 La、Yd 均为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum),菌株J 为鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)。(2)研究乳酸菌单菌株及其混合菌株的发酵特性,通过对单菌株和混合菌株的发酵上清液分别作去酸、去蛋白及去过氧化氢处理来测定其抑制肠道病原菌的能力,并利用响应面优化混合乳酸菌发酵乳的制备条件。结果表明,混合乳酸菌在发酵10h后的酸度为120.07°T,高于单菌株发酵;去酸后的4株菌株发酵上清液对3种病原菌均没有抑制作用;发酵上清液去除蛋白后,菌株L.plantarum La对大肠杆菌抑制作用有影响而对沙门氏菌抑制作用影响不显著(P0.05),菌株L.rhamnosusJ对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制作用并无影响(P0.05),菌株L.fermentum Xn对艰难梭菌抑制作用显著(P0.05),菌株L.rhamnosums J、L.plantarum Yd、L.plantaarum La对艰难梭菌的抑菌作用有所下降但并不显著(P0.05);发酵上清液排除过氧化氢后,4株菌均对大肠杆菌的抑制作用发生显著变化(P0.05),菌株L.fermentum Xn、L.plantarum Yd对沙门氏菌和艰难梭菌抑制作用影响显著(P0.05),菌株L.plantarum La对沙门氏菌影响显著(P0.05)而对艰难梭菌影响不显著(P0.05),菌株L.rhamnosus J对沙门氏菌和艰难梭菌的抑菌作用影响均不显著(P0.05)。乳酸菌混合发酵后,对大肠杆菌的抑菌圈直径为30.81mm,对沙门氏菌的抑菌圈直径为26.22mm,对艰难梭菌的抑菌圈直径为23.53mm。混合乳酸菌发酵乳制备的最佳条件是:糖添加量为6.06%,接种量为3.88%,发酵温度为39℃,此模型下发酵乳活菌数为9.501g(CFU/mL),实际测得为9.441g(CFU/mL),对大肠杆菌的抑菌圈直径为31.75±0.42mm,沙门氏菌的抑菌圈直径为26.34±0.69mm,艰难梭菌的抑菌圈直径为24.51±0.52mm,均高于单菌株发酵。(3)通过盐酸林可霉素建立小鼠肠道菌群失衡模型,利用混合乳酸菌及其发酵乳进行干预,测定小鼠肠道内双歧杆菌与肠杆菌的比值(B/E)及其体重、日摄食量、血清内毒素含量、脾指数、血清球蛋白含量与免疫球蛋白(IgG)含量。结果表明,盐酸林可霉素干预3d(60mg/次,2次/d),小鼠肠道的双歧杆菌、乳杆菌数量分别为7.541gCFU·g-1、5.861gCFU·g-1,均显著低于对照组(P0.05),而肠球菌数量显著高于对照组(P0.05)。同时,模型组小鼠肠道的B/E值显著低于对照组(P0.05),且在7d内未得到恢复。抗生素降低了小鼠肠绒毛黏膜完整性,肠腔内可见脱落的细胞团块,菌悬液干预组小鼠结肠黏膜较完整,发酵乳干预组小鼠结肠组织表面光滑,黏膜肌层恢复较好,菌悬液预防组小鼠肠绒毛轻微变短、轮廓不清,肠黏膜组织少量空泡变性,发酵乳预防组小鼠结肠黏膜较完整,肠绒毛轮廓较清晰,少量空泡变性。混合乳酸菌干预7d后,菌悬液及其发酵乳组小鼠的体重增加幅度高于对照组,日摄食量也高于模型组;菌悬液干预组、发酵乳干预组、菌悬液预防组及发酵乳预防组小鼠的血清内毒素含量均显著低于模型组(P0.05),分别为0.3725 EU·L-1、0.3631 EU·L-1、0.3758 EU·L-1 0.3831 EU·L-1;菌悬液干预组及其发酵乳干预组小鼠的脾指数分别为2.48mg·g-1、2.45mg·g-1,而菌悬液预防组及发酵乳预防组分别为2.37mg·g-1、2.16mg·g-1,均显著高于模型组(P0.05);模型组小鼠的血清球蛋白和IgG含量分别为19.82 g·L-1、0.78 g·L-1,而菌悬液干预组、发酵乳干预组、菌悬液预防组及发酵乳预防组的小鼠血清球蛋白含量分别为 25.75 g·L-1、27.54 g·L-1、22.47 g·L-1、24.06 g·L-1,IgG 含量分别为 0.92 g·L-1、0.98 g·L-1、0.85 g·L-1、0.91 g·L-1,与模型组相比,均显著升高(P0.05)。(4)利用Illumina高通量测序技术研究混合乳酸菌发酵乳对小鼠肠道菌群的调节作用,并对小鼠结肠组织HE染色后观察。小鼠肠道菌群组成在门的水平上,主要为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门;空白对照组小鼠肠道中厚壁菌门含量为32.68%,抗生素降低了小鼠肠道中厚壁菌门的含量,为3.87%,菌悬液预防组及发酵乳预防组小鼠肠道中厚壁菌门含量分别为30.44%、33.90%,混合乳酸菌及其发酵乳干预后,厚壁菌门含量恢复至对照组的水平,分别为35.30%、32.39%;空白对照组小鼠肠道中拟杆菌门含量为53.58%,抗生素的干预增加了拟杆菌门的含量,为54.44%,菌悬液预防组及发酵乳预防组小鼠肠道中拟杆菌门含量分别为51.05%、49.15%,混合乳酸菌及其发酵乳的干预降低了拟杆菌门的含量,分别为50.37%、51.33%;空白对照组小鼠肠道中变形菌门的含量为7.24%,抗生素的干预增加了变形菌门的含量,为36.58%,菌悬液预防组及发酵乳预防组小鼠肠道中变形菌门含量分别为12.47%、12.73%,混合乳酸菌菌悬液及其发酵乳干预组小鼠肠道中变形菌门含量分别为7.76%、10.29%。模型组小鼠肠道在属水平上菌群主要包含·Parabacteroides spp.、Clostridium spp.及Escherichia spp.等多个属,在空白对照组与4组试验组中,菌群包含Bacteroides spp.、Lachnospira spp.、Ruminococcus spp.及未分类_S24-7属,这4个属的菌群分别占各组中菌群总量的 80.94%、76.62%、78.92%、69.51%、67.11%。Klebsiella spp.致病性较强,Klebsiella spp.在空白组中含量为0.0012%,抗生素干预后,Klebsiella spp.含量升高,为1.03%,而在其余4组中未检出;Salmonella spp.对动物致病性强,抗生素干预后,Salmonella spp.含量达到1.05%,在其余5组中未检出;Clostridium spp.主要是一类专性厌氧、革兰阳性的梭状杆菌,空白组中的含量为0.14%,抗生素干预后,Clostridium spp.在模型组中的含量升高,为20.01%,Clostridium spp.在菌悬液预防组和发酵乳预防组中的含量分别为0.08%、0.33%,混合乳酸菌菌悬液及其发酵乳干预降低Clostridium spp.含量,为0.02%、0.10%。此外,Blautia spp.可将肠道中气体转化成乙酸,使气体得以清除,并且能够在肠道内发酵产生短链脂肪酸,空白对照组中Blautia spp.的含量为0.178%,抗生素干预后,模型组中Blautia spp.的含量几乎为0,Blautia spp.在菌悬液预防组和发酵乳预防组中的含量分别为0.093%、0.106%,混合乳酸菌菌悬液及其发酵乳干预增加了Blautia spp.的含量,分别为0.087%、0.163%;Lactobacillus spp.在这5组粪便样品菌群总量中的所占比例分别为0.93%、0.26%、0.57%、0.30%和0.86%,而在模型组中未检出。
【图文】：
Ｆｉｇｕｒｅ邋３－２邋Ｂａｃｔｅｒｉｏｓｔａｔｉｃ邋ａｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ－ｆｒｅｅ邋ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ邋ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ邋ｏｆ邋ＬＡＢ邋ａｎｄ邋ｉｔｓ邋ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ邋ａｆｔｅｒ逡逑ｔｈｅ邋ｒｅｍｏｖａｌ邋ｏｆ邋ｐｒｏｔｅｉｎ，邋ｈｙｄｒｏｇｅｎ邋ｐｅｒｏｘｉｄｅ邋ｏｒ邋ａｃｉｄ邋ａｇａｉｎｓｔ邋ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ邋ｂａｃｔｅｒｉａ逡逑由图３－２可知，发酵上清液去除蛋白后，菌株如ｒｗｍ邋Ｌａ对大肠杆菌抑制作用有逡逑影响而对沙门氏菌抑制作用影响不显著（Ｐ＞０．０５），，菌株Ｌ．邋ｒＡａ／ＴｍｏｍｙＪ对大肠杆菌和沙逡逑门氏菌的抑制作用并无影响（Ｐ＞０．０５），菌株娭ｍ邋Ｘｎ对艰难梭菌抑制作用显逡逑
扬州大学硕士学位论文．０５），菌株ｒ／＾／Ｔｍｏｍｓ１邋Ｊ、Ｌ．夕／ｆｌ扣ａｒｗｍ邋Ｙｄ、Ｌ．户／ａｗ如＊ｗｍ邋Ｌａ对艰难梭菌的抑菌下降但并不显著（Ｐ＞0．0５）。发酵上清液排除过氧化氢后，４株菌均对大肠杆菌用发生显著变化（Ｐ＜０．０５），菌株对沙门氏菌菌抑制作用影响显著（户＜0．０５），菌株Ｚ．邋ｐ／⑴Ｌａ对沙门氏菌影响显著（尸＜０．０５难梭菌影响不显著（Ｐ＞0．0５），菌株对沙门氏菌和艰难梭菌的抑菌逡逑响均不显著（Ｐ＞0．0５）。去酸后的４株菌株发酵上清液对３种病原菌均没有抑制此可以推断，单菌株发酵发挥抑菌作用的主要因素是乳酸菌生长过程中产生的酸。逡逑合乳酸菌发酵对肠道病原菌的抑制作用逡逑图３－２可知，菌株Ｊ发酵上清液对革兰氏阳性的艰难梭菌抑制效果较好Ｘｎ、Ｌ．逦Ｙｄ、Ｌ．邋／？／ａ咐ａｒｗｗ邋Ｌａ发酵上清液对革兰氏阴性大沙门氏菌的抑制效果较好。因此，进一步对比这４株单菌株发酵上清液以及混合液对病原菌的抑制效果。结果如下图３－３、３－４所示。逡逑＿
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R151;TS201.3
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本文编号：
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