金属锰致H9c2心肌细胞毒性的作用研究

发布时间：2020-03-22 23:55

【摘要】：目的通过体外H9c2心肌细胞实验,测定不同锰浓度处理组氧化应激、线粒体损伤、凋亡和自噬相关蛋白的表达情况,探讨金属锰染毒对H9c2心肌细胞的毒性作用。方法(1)采用0,100,200,400μM氯化锰(MnCl_2)分别对大鼠H9c2心肌细胞进行染毒24小时后,在倒置相差显微镜下观察细胞形态,应用MTT法检测细胞存活率。(2)采用Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒检测H9c2细胞凋亡率,Western blot检测凋亡蛋白Caspase 3、Bcl-2的相对表达量。(3)采用南京建成试剂盒检测H9c2心肌细胞外液心肌酶谱AST和LDH水平。(4)采用南京建成试剂盒检测H9c2心肌细胞内SOD和CAT水平。采用1mM NAC提前1小时处理H9c2细胞后染锰24小时,染锰剂量同上,MTT法检测细胞存活率。(5)采用DCFH-DA荧光探针检测H9c2心肌细胞内ROS水平,JC-1荧光探针检测线粒体膜电位水平。(6)Western blot检测不同浓度染锰后,H9c2心肌细胞自噬相关蛋白mTOR、p-mTOR、Atg7、p62、Beclin1、Atg5、Atg3、LC3蛋白的相对表达量。此外,采用50μM的CQ提前2小时处理H9c2细胞后染锰24小时,染毒剂量为200μM,Western blot检测LC3和p62蛋白相对表达量,共聚焦检测LC3和p62蛋白免疫荧光。10 nM的Rapamycin提前1小时处理后,染锰方法同上,Western blot检测mTOR、p-mTOR蛋白相对表达量。结果(1)与对照相比,当染锰浓度≥200μM时,随着染锰浓度的增高,H9c2细胞存活率显著下降(P0.05),并可引起H9c2细胞不同程度的损伤和形态学改变。染锰时间≥12h时,随着染锰时间的增加,各组间H9c2细胞存活率出现显著性差异(P0.05),细胞存活率下降。(2)随着染锰剂量的增加,H9c2心肌细胞凋亡率增加;各组间凋亡率有显著差异(P0.05),对照、低、中、高剂量组凋亡率分别为(4.275±2.103%)、(5.225±2.138%)、(10.175±1.756%)、(16.625±5.847%)。各组间Caspase3蛋白相对表达量无明显差异,但Cleaved-Caspase 3蛋白相对表达量显著增高,400μM剂量组显著高于其他三组(P0.05),Bcl-2蛋白相对表达量呈下降趋势,400μM剂量组显著低于对照组(P0.05)。(3)随着染锰剂量的增加,H9c2细胞外液AST无明显改变,但LDH水平逐渐升高,对照、低、中、高剂量组LDH水平分别为(378.162±19.243)U/L、(393.297±28.602)U/L、(410.378±29.219)U/L、(432.432±24.526)U/L。200μM剂量组和400μM剂量组显著高于对照组(P0.05,P0.001)。(4)NAC抗氧化剂+染锰组与仅有染锰组相比,细胞存活率显著提高(P0.001);随着染锰剂量的增加,H9c2细胞内SOD水平呈下降趋势,染锰组SOD水平均显著低于对照组(P0.001)。CAT含量也呈下降趋势,400μM剂量组(2.210±1.601 U/mgprot)显著低于对照组(4.400±0.790U/mgprot)(P0.05)。(5)随着染锰剂量的增加,H9c2细胞内ROS水平显著升高,200μM和400μM剂量组DCFH-DA荧光强度显著高于对照组(P0.001);H9c2细胞线粒体膜电位随着染锰剂量的增加而下降,200μM和400μM剂量组红色/绿色荧光平均强度与对照组相比差异均具有统计学意义(P0.001)。(6)共聚焦结果显示,对照组LC3和p62蛋白均弥散分布于胞浆中,染锰组有LC3斑点出现。Western blot结果显示,H9c2细胞400μM剂量组mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量均显著低于其余各剂量组,差异具有统计学意义(P0.05)。随着染锰剂量的增加,其中Atg7蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于其余各剂量组(P0.05),Atg5蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于200μM剂量组(P0.05),Atg3蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于100μM剂量组(P0.05);LC3I、LC3II蛋白相对表达量均呈下降趋势,LC3I蛋白相对表达量400μM剂量组显著低于其余各剂量组(P0.05),LC3II蛋白相对表达量200μM和400μM剂量组显著低于对照组和100μM剂量组(P0.05)。各组间LC3II/LC3I的比值无显著性差异(P0.05)。(7)共聚焦结果显示,与对照组相比,CQ和CQ+Mn处理组LC3蛋白和p62蛋白荧光强度均增高,胞浆内出现明显聚集成斑点状的LC3蛋白和p62蛋白,且CQ+Mn组比CQ组更为明显。Western blot结果显示,CQ+Mn处理组p62蛋白相对表达量显著升高,与对照组比差异具有统计学意义(P0.05);CQ和CQ+Mn组LC3II蛋白相对表达量分别与对照和Mn处理组相比均升高,差异均具有统计学意义(P0.05),且CQ+Mn处理组LC3II/LC3I比值显著高于对照与Mn处理组(P0.05),LC3I蛋白相对表达量在各组间无显著差异(P0.05)。(8)Rapa处理组和Rapa+Mn处理组mTOR和p-mTOR蛋白相对表达量均降低,与对照和Mn处理组相比差异均具有统计学意义(P0.05)。对照和Mn处理组之间,Rapa处理组和Rapa+Mn处理组之间无显著差别(P0.05)。结论(1)MnCl_2染毒可导致H9c2心肌细胞形态发生变化,升高细胞凋亡率,降低细胞存活率。(2)MnCl_2染毒可导致H9c2细胞LDH水平升高。(3)MnCl_2染毒可引起H9c2细胞ROS水平升高,线粒体膜电位降低,抗氧化能力下降,氧化应激水平增高。(4)MnCl_2染毒可以抑制mTOR信号通路,启动介导自噬体形成的泛素样接合系统,从而激活自噬。
【图文】：

图 3 各 H9c2 心肌 胞形态学观察（10×）Figure 3 Morphological observation of H9c2 cardiomyocytes in each group (10×)[注]：各图右下角标尺为 100 μm。表 2 锰染毒对 H9c2 心肌细胞凋亡率的影响（ x±SD，%）Table2 The apoptosis rates of different manganese-treated H9c2 cardiomyocytes（ x±SD，%）MnCl2(μM) n 凋亡率 F 值 P 值0 4 4.275 ± 2.103 11.077 0.001100 4 5.225 ± 2.138200 4 10.175 ± 1.756*400 4 16.625 ± 5.847*#@[注]：采用 ANOVA 的 LSD 法进行组间两两比较。*与对照组比较，P＜0.05；#与 100 μM 剂量组比较，P＜0.05；@与 200 μM 剂量组比较，P＜0.05。

37图 9 氯化锰对 H9c2 胞 ROS 的影响Figure 9 The ROS levels of different manganese-treated H9c2 cells照组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组；E：DCFH-DA 平均荧 的 LSD 法进行组间两两比较。*与对照组比较，P＜0.05；***与对照组比较，
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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本文编号：2595821