焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞损伤的实验研究

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《华北理工大学》 2015年

焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞损伤的实验研究

李红丽  

【摘要】：目的焦炉逸散物(coke oven emission,COE)是在焦化生产过程中释放的主要环境污染物,除颗粒物外,具有多种致突变和致癌性的多环芳烃。长期暴露于COE容易引发机体产生慢性炎症和肿瘤,而炎症又可以促进肿瘤细胞的转化、生长和转移。本研究应用不同染毒剂量的焦炉逸散物有机提取物作用于16HBE细胞建立24h和5d细胞染毒模型。初步探讨焦炉逸散物有机提取物对支气管上皮细胞的损伤情况。为后续COE暴露人群的效应性生物标志物分析提供依据和线索。方法1 COE有机提取物作用于16HBE细胞建立24h染毒模型:将人支气管上皮细胞系16HBE接种在含有10%的胎牛血清的MEM培养基中,在37℃和5%CO2的条件下传代培养。当细胞融合率达70%时用不同浓度的焦炉逸散物有机提取物处理24h,作用浓度依次为5mg/L、10mg/L、20mg/L,胎牛血清浓度为5%。同时设置0.1%DMSO的COE溶剂对照,每个剂量组均设置平行样。2 COE有机提取物作用于16HBE细胞5d染毒模型建立:细胞培养条件、染毒物质的剂量与24h模型相同,连续染毒5d,每次更换新的含COE有机提取物的培养基,每个剂量组均设立平行样。3应用MTT和乳酸脱氢酶(LDH)释放实验评估COE对16HBE细胞的细胞毒性。4应用流式细胞仪检测16HBE细胞内活性氧(ROS)的释放水平。5应用彗星实验检测16HBE细胞的DNA损伤情况。6应用悬液芯片Human Th17Cytokine Panel 15-Plex检测上清液中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-17F、IL-21、IL-22、IL-23、IL-25、IL-31、IL-33、γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、可溶性细胞表面分化抗原40配体(s CD40L)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的表达情况。7应用蛋白免疫印迹方法检测IκBα、P-IκBα、P65和P-P65蛋白表达水平。结果1 20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,细胞存活率为89.38%(P0.05),LDH释放量为147.68%(P0.05)。10 mg/L和20 mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,LDH释放量分别为124.39%和149.64%(P0.01)。说明COE有机提取物可以损伤16HBE细胞,染毒周期增加,毒性亦增加。2 COE有机提取物无论24h染毒还是5d染毒均能检测到活性氧的释放,随着染毒剂量的增加而逐渐升高(P0.01)。在24h染毒的模型中,5mg/L低剂量组的细胞平均荧光强度相较对照组增加的倍数值比在5d模型中低。在24h模型中增加的倍数是14.47倍,5d模型中为17.85倍。3单细胞凝胶电泳结果显示,细胞出现DNA损伤。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,尾部DNA百分含量增加83.51%(P0.01),Olive尾距指标增加76.47%(P0.05)。20mg/L COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,尾部DNA百分含量与对照组相比较增加89.28%(P0.01),Olive尾距指标值增加量为照组的117.07%(P0.01)。4COE有机提取物染毒16HBE细胞24h后,IL-10的表达量分别是1.25±0.54、1.39±0.13和(1.90±0.73)pg/m L,具有良好的剂量-效应关系(r=0.98,P0.05)。IL-23仅在该模型的中、高剂量组表达。COE有机提取物染毒16HBE细胞5d后,IL-10在各剂量组的表达量依次为1.71±0.02、1.49±0.13和(2.82±0.16)pg/m L。IL-1β仅在该模型中表达。表明COE有机提取物影响16HBE细胞炎性因子的表达。5 COE有机提取物染毒24h对16HBE细胞中NF-κB通路蛋白表达的影响:IκBα蛋白表达量呈现下降趋势,在5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L COE组下降量分别为对照组的26%、33%和56%(P0.05)。P-IκBα蛋白表达量在中、高剂量组上升显著,在10mg/L COE组中的增加量为对照组的79%(P0.05),在20mg/L COE组的表达量是对照组的2.02倍(P0.05)。P-P65在10 mg/L COE组的表达量为对照组的3.84倍(P0.05),在20 mg/L COE处理组,其表达量为对照组的6.43倍(P0.05)。P65蛋白表达量无明显变化。结论1 IL-23和IL-1β分别反映焦炉逸散物染毒24h和5d的炎性损伤,IL-10可以反映焦炉逸散物有机提取物染毒16HBE细胞24h和5d的炎性损伤。2炎性和免疫损伤可能是焦炉逸散物致癌的早期效应改变。3焦炉逸散物有机提取物致16HBE细胞损伤与NF-κB信号活化有关。

【关键词】：
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

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本文编号：260422