砷诱导自噬介导骨骼肌胰岛素抵抗及牛磺酸的保护作用研究

发布时间：2020-03-29 12:28

【摘要】：目的:慢性砷暴露会引起胰岛和肝脏发生自噬性死亡,并且进一步验证砷会影响胰岛分泌胰岛素的主要功能。有研究表明牛磺酸缓解砷暴露所导致的胰岛素抵抗。但是在骨骼肌中,牛磺酸是否是通过抑制自噬缓解胰岛素抵抗的保护作用尚不明确,因此,本研究拟探讨三氧化二砷(As_2O_3)诱导的C57BL/6鼠骨骼肌自噬介导胰岛素抵抗的作用以及牛磺酸的保护作用。材料与方法:在体内实验中,以C57BL/6小鼠为研究对象,通过自由饮水方式暴露于浓度为1~4 mg/L的As_2O_3中,并在4 mg/L组提前予以250 mg/(kg.d)牛磺酸灌胃,持续12周。通过口服葡萄糖耐量试验(OGTT)检测C57BL/6小鼠的葡萄糖耐受情况;苏木素-伊红染色(HE)染色观察骨骼肌组织形态结构;过碘酸希夫(PAS)染色法检测骨骼肌中糖原含量的变化;用免疫印迹法(Western blot)检测骨骼肌中磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt/Akt)、葡萄糖转运蛋白(GLUT4)、脂肪酸转运酶(CD36)及自噬生物标记物LC3-II蛋白和p62蛋白的表达情况;用GPO-PAP法检测骨骼肌中脂质含量。体外实验中,以C2C12细胞为研究对象,在其分化为肌管细胞的基础上,暴露于含1~4μM的As_2O_3的培基中48 h,用Western blot法检测细胞中p-Akt/Akt、GLUT4、CD36及自噬生物标记物LC3-II蛋白和p62蛋白的表达情况;用吖啶橙(AO)染色法检测细胞内酸性自噬泡(AVOs)的形成情况;用葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测培基中葡萄糖含量;用GPO-PAP法检测细胞中的脂质含量。用自噬抑制剂3-MA抑制自噬,判断As_2O_3引起的细胞自噬是否是引起细胞糖脂代谢改变的主要原因;用牛磺酸干预处理,检测牛磺酸是否通过抑制自噬来缓解As_2O_3引起的糖脂代谢异常。结果:暴露于不同浓度的As_2O_3(1~4 mg/L)后,C57BL/6小鼠的糖耐量明显降低,经提前予以250 mg/(kg.d)牛磺酸灌胃,得到一定缓解;p-Akt/Akt和GLUT4的表达水平随浓度逐渐减少,并被牛磺酸所逆转。PAS染色结果显示:As_2O_3暴露组骨骼肌中糖原含量明显减少,可以被牛磺酸所逆转;HE染色结果显示,在高浓度组,出现明显的异位脂质蓄积,牛磺酸组骨骼肌形态未见明显异常;且CD36的表达水平随浓度逐渐上升,牛磺酸干预组会有所缓解;TAG含量检测结果显示,高剂量组的TAG含量明显高于对照,牛磺酸干预处理组的TAG含量较高剂量组明显下降。鼠骨骼肌中LC3-II和p62的表达水平随As_2O_3浓度的升高而增加,并且被牛磺酸所缓解。暴露于1~4μM的As_2O_3中48 h后,胰岛素刺激糖摄取(ISGU)结果显示,随着剂量的增加,培基中的葡萄糖含量逐渐加多;p-Akt/Akt和GLUT4的表达水平随浓度逐渐减少;且CD36蛋白的表达水平随浓度梯度逐渐上升,TAG含量随剂量逐渐上升;AO结果显示,随剂量的上升,AVOs含量逐渐增多,提示自噬的上调;经3-MA预处理后,砷暴露导致的C2C12细胞的自噬生成得到抑制,AVOs的含量下降;且ISGU及p-Akt/Akt与GLUT4的表达均得到缓解;CD36蛋白的表达及TAG的含量相较于染毒组有一定程度缓解;牛磺酸预处理后,砷暴露引起的自噬和糖脂代谢异常均得到缓解。结论:As_2O_3通过诱导自噬引起骨骼肌葡萄糖摄取量的减少和脂质蓄积。牛磺酸可通过抑制自噬缓解As_2O_3引起的骨骼肌的葡萄糖摄取量的减少和脂质蓄积,进而缓解胰岛素抵抗。
【图文】：

糖原含量,葡萄糖耐量,牛磺酸,处理组

高剂量处理组小鼠的血糖明显高于对照组，牛磺酸干预组的血糖低于高剂量组，且具有统计学差异（如图1A 所示）；OGTT-AUC 结果显示，4 mg/LAs2O3处理组明显高于对照组，而牛磺酸干预组低于 4 mg/LAs2O3处理组，表明产生砷导致鼠产生葡萄糖耐受，且牛磺酸可缓解砷所致的葡萄糖耐受（如图 1B 所示）。PAS 染色结果显示，经 As2O3饮水处理后，，小鼠骨骼肌中糖原含量明显减少，牛磺酸干预后，鼠骨骼肌糖原含量上升（如图 1C 所示）。图 1 As2O3对 C57BL/6 鼠葡萄糖耐量及鼠骨骼肌糖原含量的影响（A）小鼠口服葡萄糖耐量试验。（B）葡萄糖耐量曲线下面积。（C）小鼠骨骼肌切片PAS 染色。*与对照组相比，P<0.05；#与高剂量组相比，P<0.05。

GLUT4蛋白,牛磺酸,蛋白,胰岛素敏感性

大连医科大学硕士学位论文1.2 As2O3暴露对 C57BL/6 鼠骨骼肌 p-Akt 蛋白以及 GLUT4蛋白表达的影响经 As2O3处理后，C57BL/6 小鼠骨骼肌 p-Akt/Akt 蛋白与 GLUT4 蛋白的表达呈现明显的下降的趋势，牛磺酸干预后，p-Akt/Akt 蛋白及 GLUT4 的表达水平都较高剂量组有一定程度的上升（如图 2 所示），表明牛磺酸可以缓解砷所导致鼠骨骼肌胰岛素敏感性的下降。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114

【参考文献】