CNC-bZIP蛋白NFE2L1在砷致脂肪细胞脂质分解代谢紊乱中的作用研究

发布时间：2020-03-30 03:24

【摘要】：目的:砷是一种广泛存在于自然界的类金属元素,长期低浓度砷暴露,会增加包括糖尿病、高血压和动脉粥样硬化等慢性病的发病风险。有研究指出砷暴露可使脂肪细胞脂质分解加剧,进而影响脂质代谢,然而具体机制尚不明确。在脂质代谢调节中,核转录因子NFE2L1起到了重要作用。同时,本研究组已证实,iAs~(3+)可强烈诱导各亚型NFE2L1蛋白表达。基于以上研究结果,本研究将着重探究无机砷暴露对于脂肪细胞脂质分解代谢和NFE2L1表达的影响。随后,进一步分析NFE2L1调节脂肪细胞脂质分解代谢机制以及在砷致脂肪细胞脂质分解紊乱中发挥的作用。研究方法:1.应用C57BL/6雌性小鼠通过饮水进行砷暴露,同时设对照组和砷暴露组,将近乎于病区真实暴露场景的三价和五价无机砷1:1混合,饮水暴露16周;2.应用NFE2L1脂肪细胞特异性敲除的C57BL/6雄性小鼠,同时设立对照组,正常饮水饮食至16周;3.通过葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验检测小鼠葡萄糖耐受情况和胰岛素反应敏感性;4.收取主要组织称量脏器系数;5.利用病理切片HE染色观察砷暴露后小鼠脂肪细胞的形态改变及脂质蓄积情况;6.分离NFE2L1缺失小鼠的白色脂肪组织,提取脂肪原代细胞,给予10μM三价无机砷处理24小时,证实在砷暴露条件下NFE2L1缺失是否影响脂解酶表达;7.利用qRT-PCR技术检测小鼠NFE2L1和脂质分解相关指标的mRNA表达水平;8.利用Western Blot技术检测小鼠脂质分解相关指标的蛋白表达;9.利用染色质免疫共沉降实验分析NFE2L1蛋白与脂解酶启动子结合情况;10.利用荧光素酶报告基因实验明确NFE2L1对脂解酶的转录调控作用。结果:1.砷暴露影响小鼠糖脂代谢:在其他基础指标无明显变化条件下,葡萄糖耐量和胰岛素耐量实验结果显示,砷处理组小鼠出现明显的葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗;2.砷暴露导致成年雌性小鼠脂肪细胞体积减小并上调脂解酶RNA表达。病理切片HE染色结果提示处理组脂肪细胞体积减小,脂解酶RNA表达水平升高,但蛋白表达变化不明显;3.Nfe2l1缺失导致成年雄性小鼠脂肪细胞脂解酶表达减少。Nfe2l1缺失后小鼠脂解酶表达在RNA和蛋白水平均降低;4.Nfe2l1在砷引发小鼠脂肪细胞脂解酶表达增多中起到调节作用。小鼠脂肪原代细胞经砷处理后,Nfe2l1缺失组细胞脂解酶RNA升高水平明显弱于对照组,对照组砷处理后升高明显;5.NFE2L1多个亚型在脂解酶启动子区域存在结合情况。染色质免疫共沉降结果显示,NFE2L1-741长亚型和453短亚型蛋白在Lipe2基因启动子ARE区域有结合;6.NFE2L1通过与ARE序列结合转录调控HSL表达。荧光素酶报告基因实验结果显示,NFE2L1-741长亚型对于包含ARE序列的Lipe2启动子具有明显的转录调控作用。NFE2L1-453短亚型对于包含ARE序列的Lipe2启动子同样具有明显的转录调控作用,当ARE序列发生点突变以及启动子中不包含ARE序列时,转录调控作用明显减弱。结论:1.体内实验:无机砷长期暴露可引起体内NFE2L1表达增多,脂解酶表达增多,脂质分解加剧,脂肪细胞储脂能力减弱,提示该过程可能加剧了糖脂代谢紊乱。2.体外实验:无机砷暴露条件下,脂肪细胞NFE2L1表达增多,并对脂解酶的表达起到调节作用。其机制可能为:在砷刺激条件下,NFE2L1活化、入核与sMAFs蛋白和HSL编码基因Lipe2启动子ARE结合,上调该基因表达。HSL长期高水平表达,ATGL、MGL和PLIN1等脂解酶也随之升高,可导致脂肪细胞脂质分解过程的加剧进行。
【图文】：

成年 C57BL/6雌性小鼠，随机分为对照组、5 ppm 三价、五价无机砷1:1混合处理组。进行为期16周的饮水砷暴露实验。在砷暴露期间，进行摄食饮水和体重变化情况监测，结果显示处理组小鼠每日饮水量低于对照（图3.1A），但两组小鼠摄食水平、体重变化和脏器系数无明显差异。在16周砷暴露后，对两组小鼠进行葡萄糖耐量实验和胰岛素耐量实验。结果显示，处理组小鼠出现明显的葡萄糖不耐受（图3.1 D）和胰岛素抵抗（图3.1 E）。图3.1 砷暴露影响成年雌性小鼠葡萄糖耐量和胰岛素敏感性应用12-14周雌性 C57BL/6小鼠，5 ppm 三价、五价无机砷1：1混合饮水，持续暴露16周，，n = 6-8。A：饮水摄食情况监测。*p < 0.05 vs. Veh。B：小鼠体重变化趋势。C：小鼠脏器系数。gWAT：性腺旁脂肪，iWAT：皮下脂肪

中国医科大学硕士学位论文为验证 Nfe21l 在小鼠脂肪细胞脂质分解过程中发挥的作用。我们应用 Nfe2l1 脂肪细胞特异性敲除的 C57BL/6 成年雄性小鼠，分离性腺旁脂肪和皮下脂肪，提取RNA 和蛋白进行指标检测。RT-PCR 结果表明，Nfe21l(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂质分解相关脂解酶基因表达均呈明显降低，结果具有统计学差异（图 3.3 C）；性腺旁脂肪脂解酶基因 Lipe2 和 Mgl 呈明显降低，其他相关基因变化不明显（图 3.3 A）。Western Blot 结果显示，Nfe2l1(f)-KO 小鼠皮下脂肪脂解酶蛋白表达下降趋势与 RNA趋势一致（图 3.3 D）；内脏脂肪脂解酶蛋白表达下降趋势相对较弱（图 3.3 B）。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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本文编号：2606954