镉通过抑制自噬流和激活Akt-Beclin1通路诱导神经细胞自噬关联凋亡的机理研究

发布时间：2020-03-31 12:02

【摘要】：本研究采用细胞培养、MDC和DAPI染色、荧光蛋白标记、RNA干扰、Western Blot分析等细胞和分子生物学技术和方法,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,系统地研究了镉诱导细胞凋亡与自噬体形成、自噬流的关系,并深入解析了Akt-Beclin 1通路在镉诱导自噬流阻断导致神经细胞凋亡中的作用及其机理。结果如下:1镉诱导神经细胞自噬涉及自噬流阻断PC12细胞和小鼠原代神经细胞或感染Ad-GFP-LC3的PC12细胞和小鼠原代神经细胞用10和20μM镉处理8、12、24 h后,经MDC染色分析细胞内MDC荧光强度,计数GFP-LC3 puncta变化;PC12细胞和小鼠原代神经细胞,在不同浓度镉(0-20μM)处理8 h或在10μM镉处理0-24 h后,用Western blot分析LC3-I/II和p62水平变化。结果显示,镉引起PC12细胞和小鼠原代神经细胞中MDC荧光强度增加;镉处理细胞中大GFP-LC3 puncta出现并增多;Western blotting显示镉以浓度和时间依赖的方式引起细胞LC3-II和p62水平升高。提示:镉诱导神经细胞自噬涉及自噬流阻断。2镉诱导自噬导致神经细胞凋亡3-MA是一个常用的自噬体形成抑制剂,我们观察了3-MA对镉诱导神经细胞MDC荧光强度、GFP-LC3 puncta表现和凋亡的影响;通过构建慢病毒shRNA LC3-I/II下调PC12细胞LC3-I/II,观察镉诱导细胞MDC荧光强度和凋亡变化。结果显示,3-MA抑制镉诱导神经细胞MDC荧光强度以及镉引起的大GFP-LC3puncta形成,于此同时3-MA也削弱镉诱导细胞凋亡。同样的,下调LC3-I/II显著降低镉诱导神经细胞MDC荧光强度和凋亡。提示:镉诱导自噬导致神经细胞凋亡。3镉阻断神经细胞自噬流导致自噬体积累和凋亡使用重组腺病毒表达mCherry-GFP串联双荧光标记LC3(Ad-mCherry-GFP-LC3)感染PC12细胞和小鼠原代神经元分析镉诱导细胞自噬流表现,以及应用氯喹(CQ),一个常用的自噬流抑制剂,进一步确认自噬流状态在镉诱导自噬致神经细胞凋亡中作用。结果显示,镉引起mCherry和GFP-LC3共定位的增多,暗示镉阻断神经细胞内自噬流;通过CQ抑制自噬流观察到,CQ进一步提高镉诱导神经细胞MDC荧光强度及Cleaved-caspase-3和Cleaved-PARP表达、加重镉诱导神经细胞凋亡。这些结果表明:镉阻断神经细胞自噬流导致自噬体积累和凋亡。4镉通过激活Akt-Beclin 1通路诱导自噬涉及自噬流阻断导致神经细胞凋亡通过Western Blot观察暴露于镉中神经细胞Akt和Beclin 1水平变化;构建慢病毒shRNA Beclin 1下调神经细胞Beclin1表达,观察镉诱导细胞MDC荧光强度及凋亡变化;通过Akt抑制剂或腺病毒钝化Akt(Ad-dn-Akt)抑制Akt活性,观察镉诱导细胞MDC荧光强度、大GFP-LC3 puncta、自噬流和凋亡表现。结果显示,镉诱导神经细胞Akt(Ser473)和Beclin 1(Ser295)磷酸化;下调Beclin 1减弱镉诱导细胞MDC荧光强度、Cleaved-caspase-3表达和凋亡;Akt抑制剂减弱镉诱导MDC荧光强度增加及保护抗镉诱导细胞凋亡;钝化Akt(dn-Akt)活性抑制镉诱导Beclin 1磷酸化、大GFP-LC3 puncta形成和细胞凋亡;重要的是,钝化Akt活性部分逆转镉诱导神经细胞自噬流阻断。提示:镉通过激活Akt-Beclin 1通路诱导自噬涉及自噬流阻断导致神经细胞凋亡。
【图文】：

正噬[23]

UVRAG 不参与 噬途 中，而是存在于 内体（endosome） 构上。其早在 2006 年，Liang 等就 先报道 UVRAG 与 Beclin 1 Vps34 形成复 体，，促噬体 形成[36]，以 Liang 随 篇研究也说明 UVRAG 促进了 噬体 成 与 体 融[37]；这与 Itakura 在 2008 年报道 UVRAG 不参与 噬不[31]，关于 UVRAG 争议，Itakura 为 UVRAG 可能通 Atg9 间 调控 噬2009 年两 验室同时在 Nature Cell Biology 上报道了 能与 Becl1 Vps34 复 体 分 —Rubicon （ Run domain protein as Beclininteracting and cystein-rich containing ）[34, 35]； Rubicon Becl1 Vps34-UVRAG 复 体上，从而 制 噬体与 体 融 ，沉默 Rubicon 进了 噬体 成熟。最近，Kim 等报道 UVRAG 促进 噬体与 体 融 ，但是 UVRAG不能促进 噬体 生成，mTORC1 能磷酸化 UVRAG Ser498，促进了 UVRA与 Rubicon ，从而 噬体与 体 融[38]。 已有研究 ，4 简单 表 了 Beclin 1 Vps34 复 体在 噬中 作用。
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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本文编号：2609049