麦胚球蛋白组学分析及其对肠道微生物区系的影响研究

发布时间：2020-04-08 08:12

【摘要】：麦胚占整个小麦籽粒质量的3%,被营养学家誉为“人类天然的营养宝库”。麦胚中球蛋白占总蛋白比约20%,具有增强免疫力、抗炎、抗氧化等生理活性,可作为植物源的免疫调节剂。采用蛋白质组学结合生物信息学对麦胚球蛋白的蛋白质组、功能域、二三级结构进行了分析预测;多组学验证麦胚球蛋白对模型小鼠的免疫调节作用及机制,并研究其对肠道微生物区系及代谢产物的影响。包含以下研究内容:(1)基于蛋白质组学的麦胚球蛋白的组成分析、功能注释、功能域预测和二、三级结构模拟。采用红外色谱、扫描电镜、变性电泳对不同沉淀方式的麦胚球蛋白进行了表征,发现三级乙醇沉淀适合麦胚球蛋白的纯化;采用LC/MS对麦胚球蛋白的蛋白质组进行分析,显示麦胚球蛋白有1575个蛋白,584个蛋白质组,主要由麦胚球蛋白家族组、热休克蛋白组、组蛋白类、典型功能蛋白及未表征蛋白组成。对鉴定所得的蛋白质进行GO功能注释和KEGG Pathway分析发现麦胚球蛋白共涉及31种分子功能,47种细胞组成和87种生物过程,并参与Systemic lupus erythematosus、Alcoholism、Ribosome、Viral carcinogenesis、Spliceosome等199条代谢通路,其中参与免疫调节类信号通路55类,占总数的22.5%;PPI分析发现主要涉及蛋白质的剪接折叠网络、生物酶修饰活化网络、蛋白质翻译修饰网络、碳水化合物代谢网络、蛋白质分子装配网络5个互作子网络;利用CBS数据库及工具对麦胚球蛋白典型蛋白功能域预测,发现麦胚球蛋白具有免疫活性位点和营养供给作用。利用Swiss-Model和Phyre2对五类22种麦胚球蛋白的三级结构进行建模并进行可视化。结果表明麦胚球蛋白典型蛋白如Globulin 3A、Heat shock protein、Histone、WHEAT 5a2 protein可能为麦胚球蛋白免疫功能的代表性组分。麦胚球蛋白的组学分析和功能预测为下一步麦胚球蛋白的功能评价提供参考。(2)基于高通量测序和代谢组学研究麦胚球蛋白对肠道微生物区系和代谢轮廓的影响。采用麦胚球蛋白、乳清蛋白、蛋清蛋白制作不同蛋白干预小鼠模型,结果发现,麦胚球蛋白对小鼠的基础生理指标(体重、血常规、肝功能、肾功能、血脂)无显著影响,说明麦胚球蛋白正常食用安全无毒;麦胚球蛋白能够显著提高小鼠外周血IgG、IL-6的分泌情况,WG组小鼠免疫力显著提高;肠道微生物优势菌群分布依次为Lachnospiraceae nk4a 136 group、Norank bacteroidales s24-7 group、Norank lachnospiraceae、Roseburia、Unclassified lachnospiraceae、Lactobacillus、Alistipes、Lachnoclostridium。门水平上,麦胚球蛋白组Firmicutes增多,Bacteroides、Actinobacteria菌群减少;属水平上,麦胚球蛋白模型小鼠的Unclassified Lachnospiraceae、Blautia、Anaerotruncus、Anaeroplasma增加,norank Bacteroidales S24-7 group、Ruminococcaceae UCG-010、Ruminococcaceae NK4A214 group、Eubacterium nodatum group菌群减少。麦胚球蛋白能够增加肠道有益菌数量,维持肠道菌群的动态平衡。对肠道微生物多样性和免疫分子分泌水平建立数学模型发现,肠道菌群多样性和机体的免疫力相互促进。对鉴定出的代谢产物进行差异分析,发现WG-NC组的差异代谢产物53个,WG-EG组差异代谢产物30个,WG-EG组差异代谢产物为66个。这些差异涉及Biosynthesis of amino acids、Glycerophospholipid metabolism、Secondary bile acid biosynthesis、Bile secretion、Choline metabolism in cancer、Retrograde endocannabinoid signaling、Primary bile acid biosynthesis等通路,且多个代谢通路和免疫调节相关。对肠道微生物多样性和差异代谢产物进行Correlation分析和Procrustes分析,肠道菌群的结构变化和差异代谢产物具有生物学相关性。结果表明麦胚球蛋白通过模型小鼠的相关免疫因子、肠道微生物区系、代谢产物的动态变化影响机体的生理状态和免疫水平。(3)通过动物实验从免疫器官、免疫细胞、免疫分子和mRNA表达方面研究了麦胚球蛋白的免疫活性和作用机制。采用环磷酰胺建立免疫抑制小鼠模型,麦胚球蛋白干预后研究发现,麦胚球蛋白可以使模型小鼠的体重、脾脏指数和胸腺指数提高,激活小鼠LDH和ACP的活性,使机体的巨噬细胞处于活化状态;麦胚球蛋白可以提高模型小鼠总的抗氧化能力,平衡模型小鼠的氧化还原状态;麦胚球蛋白能提高小鼠淋巴细胞ATP活性;显著提高小鼠脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖能力;提高外周血CD3~+和CD4~+/CD8~+比值,从而提高模型小鼠的细胞免疫功能。外周血免疫细胞因子和免疫淋巴细胞亚型分析,免疫抑制小鼠Th1细胞向Th2细胞分化的比率提高,相互转化失衡。麦胚球蛋白可能通过提高模型小鼠脾脏T-bet mRNA的表达和降低GATA-3 mRNA的表达对免疫抑制小鼠的Th1/Th2亚群的转化进行调节。麦胚球蛋白对淋巴细胞的增殖可能通过线粒体依赖的凋亡通路促进Bcl-2 mRNA的表达、提高Bcl-2/Bax的比率来实现的。结果表明麦胚球蛋白能够在一定程度上提高免疫抑制小鼠的免疫水平,且剂量上存在线性相关性,具有生物学统计学意义。麦胚球蛋白主要是免疫和营养供给相关功能蛋白,在生物过程调控中起着重要的作用,可以将麦胚球蛋白分离提纯作为一类特医食品原料和植物源免疫调节剂。
【图文】：

麦胚蛋白的主要研究方面

氨基酸序列,蛋白质结构预测,三级结构,同源建模

图 1-3 蛋白质结构预测的主要方法及其应用范围Figure 1-3 The main methods of protein structure prediction and its application同源建模法，，基于“一个蛋白质的结构由其氨基酸序列唯一的决定”的假设（在上，由一级结构，足以获取其二级、三级结构）。一般序列同源性越高，匹配的准也就越高，建立的模型越接近于蛋白的真实结构，目前对于序列同源性大于 30%的质的一级氨基酸序列构建的蛋白质的三级结构具有生物学参考价值。韦旭钦等[27]利
【学位授予单位】：河南工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R151

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