MEHP对3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化和脂代谢的影响及机制

发布时间：2020-05-08 16:28

【摘要】：邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是邻苯二甲酸酯类物质中最常使用的增塑剂,广泛应用于食品包装材料、医疗器械、儿童玩具等,可通过多种途径进入人体。DEHP摄入机体后,可在肝脏和小肠细胞中迅速代谢成其水解产物邻苯二甲酸单-2-乙基己酯(mono-(2-ethylhexyl)phthalate,MEHP),DEHP对机体的毒性作用主要通过MEHP实现。作为一种环境内分泌干扰物(environmental endocrine disruptor,EEDs),DEHP暴露可对生物体生殖系统、神经系统、内分泌系统等多个组织系统产生毒性作用。流行病学研究和毒理学研究表明DEHP暴露可影响机体脂代谢,诱发肥胖;MEHP对3T3-L1小鼠前脂肪细胞生长具有促进作用,能够促使3T3-L1细胞分化为成熟脂肪细胞,增加细胞内脂质沉积,但其作用机制尚不清楚。本研究通过体外培养3T3-L1小鼠前脂肪细胞并给予DEHP代谢产物MEHP暴露,分析MEHP暴露对3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化和脂代谢的影响,探讨脂代谢相关信号通路和脂代谢关键基因在MEHP暴露影响3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化和脂代谢中的作用和机制,可为防治环境内分泌干扰物所致人群脂代谢相关疾病提供理论依据。第一部分MEHP对3T3-L1细胞分化和脂代谢的影响目的:明确MEHP对3T3-L1细胞分化和脂代谢的影响,探讨脂代谢关键基因在MEHP影响3T3-L1细胞分化中的作用。方法:使用含10%小牛血清的DMEM培养基体外培养3T3-L1小鼠前脂肪细胞,给予3T3-L1细胞梯度MEHP暴露。MTT法检测3T3-L1小鼠前脂肪细胞存活率;根据MTT结果确定染毒剂量与实验分组。暴露剂量与分组:空白对照(0μM MEHP),溶剂对照组(0.25‰DMSO,0μM MEHP),低剂量组(10μM MEHP),中剂量组(50μM MEHP)和高剂量组(250μM MEHP)。采用流式细胞术检测细胞周期、细胞内活性氧以及线粒体膜电位的改变;采用经典激素鸡尾酒方法进行3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化实验,并在分化过程中持续给予不同剂量MEHP暴露;油红O染色观察3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化程度;化学发光法检测甘油三酯、胆固醇水平;实时荧光定量PCR方法检测脂代谢关键基因Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγm RNA表达水平;western blot方法检测脂代谢调控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγ的表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析。结果:1.3T3-L1细胞暴露于63,125,250,500μM MEHP 24 h后,细胞存活率明显高于对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。2.各剂量MEHP组3T3-L1小鼠前脂肪细胞周期无明显改变(P0.05);与对照组相比,中、高剂量组3T3-L1细胞活性氧含量显著升高(P0.05),线粒体膜电位显著降低(P0.05)。3.诱导分化过程中可见,3T3-L1小鼠前脂肪细胞体积增大、形态变圆、细胞质内出现反光脂滴,细胞内脂质含量随MEHP暴露剂量增加而升高(P0.05);分化结束后,中、高剂量组细胞中甘油三酯含量明显高于对照组,差异具有统计学意(P0.05)。4.3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化后,MEHP暴露组中Acox-1 m RNA表达水平显著高于对照组(P0.05),中、高剂量组中Acox-1 m RNA表达显著高于低剂量组(P0.05);中剂量MEHP暴露组中FABP4和PDK4 m RNA的相对表达量显著高于对照组,高剂量组FABP4 m RNA的相对表达量显著高于其他各组,差异具有统计学意义(P0.05);高剂量组FAS和C/EBPβm RNA的相对表达量显著高于其他各组(P0.05);3T3-L1细胞中PPARγm RNA的相对表达量随着MEHP暴露剂量的增加而增加(P0.05)。5.3T3-L1小鼠前脂肪细胞诱导分化后,低、中、高剂量组中的Acox-1蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05),中、高剂量组中Acox-1蛋白表达显著高于低剂量组,差异具有统计学意义(P0.05);中、高剂量MEHP暴露组中C/EBPβ蛋白的表达水平显著高于对照组(P0.05);中剂量MEHP暴露组中FABP4蛋白表达水平显著高于对照组,高剂量组FABP4蛋白表达量显著高于其他各组(P0.05);中剂量MEHP暴露组FAS蛋白表达水平显著高于其他各组(P0.05);中剂量MEHP暴露组LPL和PDK4蛋白表达水平显著高于空白对照组,差异具有统计学意义(P0.05),中、高剂量MEHP暴露组PPARγ蛋白的表达量显著高于低剂量组和对照组,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:1.MEHP暴露能够促进3T3-L1小鼠前脂肪细胞的增殖、分化和细胞内脂质蓄积。2.MEHP暴露能够改变3T3-L1小鼠前脂肪细胞线粒体膜电位和细胞内活性氧的水平影响线粒体功能。3.MEHP暴露可通过上调Acox-1、C/EBPβ、FAS、FABP4、LPL、PDK4和PPARγ基因m RNA及其蛋白的表达影响脂代谢。第二部分MEHP对3T3-L1细胞脂代谢相关信号通路的影响目的:明确MEHP暴露对3T3-L1细胞脂代谢相关信号通路JAK-STAT信号通路和及Notch信号通路基因表达的影响,探讨JAK-STAT信号通路和Notch信号通路在MEHP影响3T3-L1前脂肪细胞分化和脂代谢中的作用。方法:3T3-L1细胞培养、实验分组以及甘油三酯、胆固醇水平检测同第一部分。Real-time-PCR方法检测JAK-STAT信号通路中JAK-1、JAK-2、JAK-3、TYK-2、STAT-1、STAT-3、STAT-5a和STAT-5b m RNA的表达水平,以及Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其配体Dll-1、Dll-4、Jagged-1、Jagged-2 m RNA表达水平;western Blot方法检测JAK-STAT信号通路中JAK-1、JAK-2、JAK-3、TYK-2、STAT-1、STAT-3、STAT-5a以及STAT-5b的蛋白表达水平,以及Notch信号通路中Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4及其配体Dll-1、Dll-3、Jagged-1以及Jagged-2蛋白表达水平。采用IBM SPSS 24.0进行统计分析。结果:1.3T3-L1细胞诱导分化后,高剂量组细胞JAK-2、JAK-3 m RNA表达显著低于其余各组(P0.05);与对照组相比,MEHP暴露组细胞TYK-2 m RNA表达显著升高,差异具有统计学意义(P0.05),中、高剂量组TYK-2 m RNA表达水平显著高于低剂量组(P0.05);高剂量组STAT-1 m RNA表达显著高于空白对照组(P0.05);MEHP暴露组STAT-3 m RNA的相对表达量显著高于对照组(P0.05);中、高剂量组中STAT-3 m RNA表达明显高于低剂量组(P0.05);高剂量组STAT-5a m RNA表达显著高于对照组和低剂量组(P0.05)。2.诱导分化后,高剂量组3T3-L1小鼠前脂肪细胞中JAK-1蛋白表达明显高于空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);MEHP暴露组细胞TYK-2蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05);中、高剂量组TYK-2蛋白表达显著高于低剂量组(P0.05);MEHP暴露组细胞STAT-3、STAT-5a蛋白表达水平显著高于对照组(P0.05),中、高剂量组STAT-3、STAT-5a表达水平显著高于低剂量组(P0.05);中、高剂量组中STAT-5b表达水平显著升高(P0.05),高剂量组STAT-5b蛋白表达水平最高(P0.05)。3.JAK-STAT信号通路基因表达水平与甘油三酯水平的相关研究发现,诱导分化后3T3-L1细胞中甘油三酯的含量与TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA和蛋白表达水平显著相关(P0.05)。4.3T3-L1细胞诱导分化后,中剂量组细胞Notch-1 m RNA的相对表达量显著高于对照组(P0.05),高剂量组Notch-1 m RNA显著高于其余各组(P0.05);Notch-3、Notch-4 m RNA表达水平随着MEHP暴露剂量升高而呈上升趋势,高剂量组显著高于其余各组(P0.05);中剂量组细胞Jagged-1 m RNA表达显著高于空白对照组(P0.05);中、高剂量组与对照组相比,3T3-L1细胞Jagged-2m RNA表达明显上升(P0.05),高剂量组Jagged-2 m RNA表达显著高于低剂量组(P0.05);高剂量组Dll-4 m RNA的相对表达量显著高于其余各组(P0.05)。5.诱导分化后的3T3-L1细胞,高剂量组细胞Notch-2蛋白表达显著高于其余各组(P0.05);中剂量组的Jagged-1表达水平明显高于空白对照组(P0.05);高剂量组细胞Jagged-2蛋白表达显著高于对照组(P0.05);高剂量组Dll-1蛋白表达水平相助高于其余各组;高剂量组与低剂量组Dll-4蛋白表达量显著升高(P0.05)。6.JAK-STAT信号通路和Notch信号通路基因m RNA和蛋白表达水平与3T3-L1细胞内TG含量的相关性研究结果显示,诱导分化后3T3-L1细胞内TG含量与JAK-STAT信号通路TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA及其蛋白表达水平显著相关;与Notch信号通路Notch-1、Jagged-2 m RNA表达水平显著相关(P0.05)。结论:1.MEHP暴露可影响JAK-STAT信号通路相关基因和蛋白的表达,影响3T3-L1细胞分化成熟和细胞内脂质蓄积。2.MEHP暴露后3T3-L1细胞中TG含量与JAK-STAT信号通路中TYK-2、STAT-3、STAT-5a m RNA及其蛋白表达密切相关。3.MEHP暴露可影响Notch信号通路中基因和蛋白表达,影响3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化成熟和细胞内脂质蓄积。4.MEHP暴露后3T3-L1细胞中TG含量与Notch信号通路中Notch-1、Jagged-2 m RNA及其蛋白表达密切相关。第三部分STAT-3在MEHP影响3T3-L1小鼠前脂肪细胞分化和脂代谢中的作用及其机制目的:构建稳定转染3T3-L1小鼠前脂肪细胞STAT-3沉默细胞株;明确JAK-STAT信号通路中STAT-3在MEHP影响3T3-L1前脂肪细胞分化和脂质水平中的作用;探讨STAT-3在MEHP所致脂代谢紊乱中的作用机制。方法:采用STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)、非沉默慢病毒(Lv/sh-NC)分别感染3T3-L1小鼠前脂肪细胞,构建稳定转染3T3-L1小鼠前脂肪细胞STAT-3沉默细胞株。采用实时荧光定量PCR方法以及western blot方法检测细胞中STAT-3的沉默效率。采用经典激素鸡尾酒法对正常3T3-L1细胞和Lv/sh-NC、Lv/sh-STAT-3稳转3T3-L1细胞进行诱导分化,并给予不同处理。实验分组为:亲本对照组(Parental)为0μM MEHP,非沉默感染组(Lv/sh-NC)为0μM MEHP,STAT-3沉默组(Lv/shSTAT-3)为0μM MEHP,暴露组包括250μM MEHP暴露STAT-3沉默组(Lv/shSTAT-3+MEHP)和250μM MEHP暴露非沉默感染组(Lv/sh-NC+MEHP)。油红O染色观察3T3-L1细胞分化程度;化学发光法检测甘油三酯、胆固醇水平;实时荧光定量PCR方法检测脂代谢调控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγm RNA表达水平;western blot方法检测脂代谢调控因子Acox-1、C/EBPβ、FABP4、FAS、LPL、PDK4、PPARγ的表达水平。结果:1.STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)以及非沉默慢病毒(Lv/sh-NC)感染3T3-L1小鼠前脂肪细胞后,感染效率较高,感染效果较好。2.Lv/sh-NC组细胞内STAT-3 m RNA和蛋白表达水平与Parental组相比均无明显变化(P0.05),Lv/sh-STAT-3组STAT-3 m RNA及其蛋白表达水平均显著低于Parental组和Lv/sh-NC组(P0.05)。3.Lv/sh-STAT-3组3T3-L1细胞内TG含量略低于Parental组和Lv/sh-NC组,但差异无统计学意义(P0.05);Lv/sh-STAT-3+NC组和Lv/sh-STAT-3+MEHP组3T3-L1细胞中TG含量明显高于非暴露Parental组、Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT-3组,差异具有统计学意义(P0.05);而Lv/sh-STAT-3+MEHP组细胞内TG含量明显低于Lv/sh-NC+MEHP组,差异具有统计学意义(P0.05)。4.Lv/sh-NC和Lv/sh-STAT-3组细胞内Acox-1、FAS、FABP4、LPL、PDK4m RNA表达水平与Parental组相比未发生明显变化(P0.05)。Lv/sh-NC+MEHP组和Lv/sh-STAT-3+MEHP组中Acox-1、FAS、FABP4、LPL、PDK4 m RNA表达水平明显高于Parental组、Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT-3组,差异具有统计学意义(P0.05)。5.与Parental组相比,Lv/sh-NC组细胞C/EBPβ基因m RNA表达水平未发生明显变化(P0.05),而Lv/sh-STAT-3组与Parental组和Lv/sh-NC组相比,细胞内C/EBPβm RNA表达水平显著降低(P0.05);Lv/sh-NC+MEHP组和Lv/shSTAT-3+MEHP组细胞C/EBPβm RNA表达水明显高于Parental组、Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT-3组(P0.05),而Lv/sh-STAT-3+MEHP组C/EBPβm RNA表达水平明显低于Lv/sh-NC+MEHP组(P0.05)。与Parental组比较,Lv/sh-NC组细胞PPARγm RNA表达水平无明显变化(P0.05);而Lv/sh-STAT-3组细胞PPARγm RNA表达水平显著低于Parental组和Lv/sh-NC组(P0.05);与非暴露Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT-3组相比,Lv/sh-NC+MEHP组和Lv/sh-STAT-3+MEHP组内的PPARγm RNA表达水平显著升高(P0.05);而Lv/sh-STAT-3+MEHP组的PPARγm RNA表达水平显著低于Lv/sh-NC+MEHP组(P0.05)。6.与Parental组相比,Lv/sh-NC组和Lv/sh-STAT-3组细胞Acox-1、FABP4、FAS、PDK4和C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平未发生明显变化;而MEHP暴露后,Lv/sh-NC+MEHP组和Lv/sh-STAT-3+MEHP组内的Acox-1、FABP4、FAS、PDK4和C/EBPβ、PPARγ蛋白表达水平显著升高(P0.05)。结论:1.采用STAT-3沉默慢病毒(Lv/sh-STAT-3)成功构建稳定转染3T3-L1小鼠前脂肪细胞STAT-3沉默细胞株。2.STAT-3能够促进3T3-L1细胞分化成熟和内脂质蓄积3.MEHP可能通过STAT-3调节脂代谢关键基因C/EBPβ和PPARγm RNA及其蛋白的表达水平在所致脂代谢紊乱中发挥作用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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