饮水有机提取物中TCEP浓度和细胞毒性以及TCEP联合BaP致细胞炎性反应的调控机制

发布时间：2020-05-09 11:21

【摘要】：三(2-氯乙基)磷酸酯(tris(2-chloroethyl)phosphate,TCEP)是一种含氯有机磷酸酯类阻燃剂。它已广泛用于塑料、纺织品、电子设备、建筑和家装材料等产品。因TCEP与高分子材料是非共价键结合,故易从材料中释放进入环境。目前,在空气、降水、地表水、地下水、饮用水以及土壤样品中均已检出TCEP。但尚缺乏环境介质中TCEP浓度的季节性变化特征的系统性报道。不过已有实验研究表明,一定剂量TCEP(≥175mg/kg bw/d)处理Scl:dd Y雄性小鼠后,可检出其肝肿瘤的形成;一定浓度TCEP(≥3.12mg/L)可引起人胚肝细胞L02和人肝肿瘤细胞Hep G2生长抑制、周期阻滞和衰老。多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,PAHs)源于环境中有机物的不完全燃烧及热分解过程,并广泛分布于环境中,且性质稳定。苯并[a]芘(benzo[a]pyrene,Ba P)是多环芳烃中致癌性最强的一种化合物,它可在体内经细胞色素P450酶代谢,诱发氧化应激和炎性反应。Ba P是常见的高活性间接致癌物和突变原,已被国际癌症研究中心列为确认致癌物。人体经吸入空气、饮水和摄食等多途径复合暴露环境中TCEP和Ba P后其机体健康可受损害。不过,TCEP和Ba P的联合毒性及其毒作用机制仍有待阐明。细胞炎性反应是环境污染物致机体健康损害的主要分子事件之一。研究表明,进入体内的Ba P经细胞色素P450酶系代谢活化后可激活白介素(Interleukin,IL)1、IL-6和IL-8等细胞炎性因子的分泌,影响肝肿瘤的发生与发展;用TCEP(175mg/kg bw/day和350mg/kg bw/day)饲养雄性B6C3F1小鼠两年后可致其肝细胞嗜酸性小体发生率增加。但是,有关TCEP和Ba P联合染毒所致细胞炎性反应的相关研究报道尚十分有限。本研究拟在课题组前期有关TCEP单独染毒处理人胚肝细胞L02和人肝肿瘤细胞Hep G2的毒性研究基础上,探究武汉市两个主要自来水厂四季水样(源水、出厂水和末梢水)有机提取物中TCEP浓度的季节性变化特点和细胞毒性,以及TCEP和Ba P联合染毒对细胞的毒性效应及其可能的调控机制。本研究分为以下两个部分:第一部分饮水有机提取物中TCEP浓度和细胞毒性目的:研究武汉市饮水有机提取物中TCEP浓度的季节性变化特点以及饮水有机提取物对肝细胞毒性和细胞凋亡的影响。方法:在四个季节,采集武汉市两个主要水厂(A水厂的源水为长江,B水厂的源水为汉江)的源水、出厂水和末梢水(共40个水样)。用固相萃取方法富集水中痕量有机污染物。用气相色谱-质谱联用技术检测有机提取物中TCEP的浓度。设一定浓度(12.5m L/m L、25.0m L/m L、50.0m L/m L和100.0m L/m L)的水有机提取物和二甲基亚砜(溶剂对照,终浓度(V/V):0.1%)处理L02细胞24h和48h,用MTT实验检测细胞存活率,并用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:在取自武汉市不同源水的自来水厂的四季水样(包括源水、出厂水和末梢水)中TCEP检出率达90%;A水厂的四季源水、出厂水和末梢水中TCEP检出浓度范围分别为:检出限(method detection limit,MDL)或MDL~676ng/L、33~78ng/L和35~257ng/L;B水厂的四季源水、出厂水和末梢水中TCEP检出浓度范围分别为:MDL或MDL~505ng/L、MDL或MDL~104ng/L和MDL或MDL~130ng/L。冬季两水厂源水中TCEP浓度(A水厂:676ng/L;B水厂:505ng/L)均高于其他季节,秋季A水厂和春季B水厂的末梢水中TCEP检出浓度最高,分别是257ng/L和130ng/L。两水厂夏季源水有机提取物细胞毒性均高于其他季节;两水厂夏、秋季出厂水和末梢水的细胞毒性均高于春冬季。两水厂的四季源水有机提取物最高浓度组(100.0m L/m L)均观察到细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:两个自来水厂净水处理工艺尚无法有效去除水中TCEP;两水厂的四季源水中TCEP浓度均呈现“冬春季高,夏秋季低”的特点,两水厂的四季源水有机提取物最高浓度组(100.0m L/m L)均可观察到细胞发生凋亡。第二部分EGFR-ERK通路调控TCEP联合Ba P致细胞炎性反应的机制目的:研究TCEP和Ba P联合染毒致肝细胞炎性反应及EGFR-MAPK信号通路的相关调控机制。方法:用一定浓度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L、50.00mg/L或200.00mg/L)和50μM Ba P单染和联合染毒Hep G2细胞24h和48h,同时设置DMSO溶剂对照组(终浓度(V/V):0.1%)。为评价TCEP致细胞毒性,MTT实验用于检测细胞存活率;选用相应试剂盒评价丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)、氧基抗氧化能力(oxygen radical absorbance capacity,ORAC)和羟基抗氧化能力(hydroxygen radical absorbance capacity,HORAC)等细胞氧化应激指标。用流式细胞术检测细胞凋亡率。用酶联免疫吸附实验检测细胞培养液中IL-6和IL-8的蛋白水平。用实时荧光定量聚合酶链反应(real time polymerase chain reaction,RT-PCR)实验检测IL-6和IL-8的m RNA表达水平。用蛋白质免疫印迹技术(western blotting)检测表皮生长因子受体(extracellular signal regulated protein kinase,EGFR)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、信号传导子及转录激活子3(signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)和核转录因子κB(nuclear factor-κ-gene binding,NF-κB)信号通路相关蛋白质(EGFR、p-EGFR、ERK、p-ERK、p38、p-p38、JNK、p-JNK、STAT3、p-STAT3、p65和p-p65)的表达。用EGFR抑制剂(AG1478)、ERK抑制剂(U0126)或p38抑制剂(SB203580)预处理Hep G2细胞1h后,再用50mg/L TCEP和50μM Ba P单独及联合处理Hep G2细胞24h,检测细胞培养液中IL-6和IL-8释放水平、IL-6和IL-8的m RNA表达水平。结果:在24和48h观察时点,与溶剂对照组相比,200mg/L TCEP单独染毒、≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P联合组显现细胞存活率降低(P0.05),IL-6和IL-8的m RNA水平上调(P0.05),细胞培养液中IL-6和IL-8蛋白释放增加(P0.05),一定浓度的TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)分别与50μM Ba P联合染毒Hep G2细胞24h和48h,可上调p-EGFR蛋白的表达(P0.05),≥3.12mg/L TCEP与50μM Ba P的联合染毒上调了p-ERK和p-p38蛋白的表达(P0.05)。与对应浓度的TCEP单独处理组比较,≥3.12mg/L TCEP和50μM Ba P联合染毒致细胞存活率降低(P0.05),且IL-6和IL-8的m RNA水平上调及细胞培养液中IL-6和IL-8蛋白的释放增加(P0.05);一定浓度TCEP(3.12mg/L、12.50mg/L和50mg/L)和50μM Ba P联合染毒上调了p-EGFR蛋白的表达(P0.05),≥3.12mg/L TCEP与50μM Ba P联合染毒上调了p-ERK和p-p38蛋白的表达(P0.05)。与仅用TCEP(50mg/L)和Ba P(50μM)联合染毒Hep G2细胞组相比,添加抑制剂(AG1478、U0126或SB203580)与TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培养细胞组的IL-6和IL-8在m RNA水平和细胞培养液中IL-6和IL-8蛋白释放水平均降低(P0.05);但是,AG1478与TCEP(50mg/L)及Ba P(50μM)共培养仅观察到p-ERK蛋白表达呈显著性降低(P0.05)。结论:TCEP和Ba P联合染毒对细胞存活的影响可能大于TCEP或Ba P的单独作用;EGFR-ERK信号通路可能参与了一定浓度TCEP与50μM Ba P联合染毒激活肝细胞释放炎性分子的调控。
【图文】：

示意图,示意图,乙腈,移液管

华中科技大学博士学位论文1mL 移液管准确量取 TCEP 标准中间液 B（103mg/L）至 100mL 棕色容量瓶，用乙腈定容，即配制成浓度为 10mg/L 的 TCEP 标准中间液 C。（4）TCEP 标准应用液的配制：如图 1 所示，由 TCEP 标准中间液 C（10mg/L）用乙腈逐级稀释成不同浓度的 TCEP 标准液。共设定了 6 个浓度梯度，分别是10μg/L、50μg/L、100μg/L、500μg/L、1000μg/L 和 5000μg/L。所有标样均注明浓度和配置日期，，贮存在 4 C 冰箱中备用，TCEP 标准贮备液有效期为 6 个月，TCEP 标准中间液和 TCEP 标准应用液有效期为 1 个月。

示意图,水样采集,示意图

图 2 水样采集布点示意图1.3 固相萃取水体中有机污染物浓度通常很低，因此检测分析时应选择恰当的有机污染富集浓缩方法。固相萃取（solid phase extract，SPE）技术是分离、富集和检测境样品中痕量有机污染物物经常采用的方法之一。SPE 技术具兼有净化和富集作用，而且有机溶剂使用量少，近年来，SPE 技术广泛用于环境样品的预处理。1.3.1 活化 SPE 柱由于 TCEP 具有一定的极性，本研究中采用 Waters Oasis HLB 固相萃取柱Waters Oasis HLB 填料是由亲脂性二乙烯苯（divinylbenzene）和亲水性 N-乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone）两种单体按一定比例聚合成的大孔共聚物。HLB 固相萃取柱通过反相的保留机理，利用“特殊的极性捕获基团”来增加对性物质（如 TCEP）的保留。向 SPE 柱内依次加入甲醇、乙腈和超纯水各 6mL，自行通过 SPE 柱。在活
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114

【参考文献】