【摘要】：目的:探讨六价铬染毒引起大鼠肾脏组织的损伤后,骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)移植对六价铬致肾脏损伤的修复作用及其修复作用机制。方法:出生5-7 d的Wistar大鼠骨髓细胞培养于培养瓶中,贴壁法纯化细胞、扩增BMSCs,流式细胞仪检测第3代BMSCs的周期以及干细胞表面标志CD44、CD90和CD45;第3代BMSCs诱导分化为脂肪细胞,油红O染色鉴定。24只Wistar大鼠随机分为对照组、六价铬致肾脏损伤的模型组和BMSCs治疗组。模型组和治疗组大鼠注射0.4 mg/kg·bw六价铬离子溶液,每周连续染毒5天,染毒30天,对照组大鼠腹腔注射相同体积生理盐水。染毒结束,治疗组大鼠移植1×10~7个BMSCs,对照组和模型组给予同体积的磷酸盐缓冲液,每天观察、记录大鼠的一般状态;细胞移植2周后,检测肾脏功能血肌酐(CR)和尿素(URE)含量;称量肾脏质量,计算肾脏系数,检测SOD活力和MDA含量;HE染色观察大鼠肾脏组织病理学改变;原子吸收法检测大鼠肾脏组织中铬含量;TUNEL法检测肾脏组织细胞凋亡率;免疫组化和western blot检测线粒体途径细胞凋亡相关蛋白Bax,Bcl-2,Cytochrome C(Cyt c)和Caspase 3以及线粒体自噬相关蛋白Beclin 1,P62,PINK1,Parkin,p-Parkin和LC3B的表达;western blot检测MAPK通路p38、p-p38、JNK、p-JNK、ERK和p-ERK蛋白的表达;激光共聚焦显微镜观察CM-Dil标记的BMSCs在肾脏组织定位。结果:1.骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定:经流式细胞仪检测,第3代BMSCs高表达间充质干细胞的表面标志物CD44、CD90,基本不表达造血系表面标志CD45;大多数细胞处于细胞分裂间期。诱导分化的脂肪细胞经油红O染色,细胞内的脂滴被染成红色。2.BMSCs移植修复六价铬致大鼠肾脏损伤:染毒后,对照组大鼠状态良好。模型组大鼠食欲下降,毛色偏黄无光泽。治疗组大鼠相较于模型组活动增多,食欲有所缓解。细胞移植2周后,模型组肾脏质量显著低于对照组(P0.05),肾脏系数显著高于对照组和治疗组(P0.05)。血液生化检测结果显示,治疗组大鼠CR和URE含量均显著高于对照组,低于模型组(P0.05)。氧化应激相关指标检测结果显示:肾脏组织模型组SOD活性显著低于对照组和治疗组(P0.05),MDA含量显著高于对照组和治疗组(P0.05)。模型组和治疗组相比,大鼠肾脏组织中六价铬含量无显著差异。HE染色显示模型组肾脏组织肾小球轻微萎缩,肾小管结构破坏,上皮细胞损害,治疗组大鼠肾脏组织病理改变明显改善。3.BMSCs移植对六价铬致大鼠肾脏组织损伤的修复作用机制:激光共聚焦显微镜观察治疗组大鼠肾脏组织有CM-Dil标记的BMSCs定位。TUNEL结果显示,治疗组大鼠肾脏细胞凋亡率显著低于模型组,高于对照组(P0.05)。线粒体途径细胞凋亡相关蛋白的检测:免疫组化结果显示:治疗组大鼠肾脏组织Bax,Cyt c和Caspase 3的表达显著高于对照组,低于模型组(P0.05);凋亡抑制蛋白Bcl-2表达显著低于对照组,高于模型组(P0.05);western blot结果显示:总蛋白模型组Bax表达显著高于对照组,治疗组Bcl-2和Bcl-2/Bax比值表达显著高于模型组,低于对照组(P0.05);治疗组Caspase 3和Cyt c的表达显著高于对照组,低于模型组(P0.05)。线粒体蛋白模型组Bax表达显著高于对照组,Bcl-2和Cyt c显著低于治疗组和对照组。去线粒体蛋白治疗组Bax,Cyt c表达显著低于模型组,高于对照组(P0.05)。线粒体自噬相关蛋白的检测:免疫组化和western blot结果,治疗组Beclin 1,PINK1,Parkin,p-Parkin和LC3B的表达显著高于对照组,低于模型组(P0.05);治疗组P62的表达显著高于模型组,低于对照组(P0.05)。MAPK信号通路的检测:结果表明治疗组p-p38/p38和p-JNK/JNK比值显著高于对照组,低于模型组(P0.05);p-ERK/ERK比值显著低于对照组,高于模型组(P0.05)。结论:六价铬可以在大鼠肾脏中蓄积,引起氧化应激反应,激活p38和JNK磷酸化、抑制ERK磷酸化,从而激活肾脏组织细胞线粒体途径的细胞凋亡和线粒体自噬。骨髓间充质干细胞移植能够修复六价铬所致的肾损伤,可能通过MAPK通路抑制线粒体途径的细胞凋亡和线粒体自噬途径进而修复肾脏损伤。
【图文】：
第 3 章 结 果3.1 BMSCs 的分离、培养与鉴定.1.1 BMSCs 的培养骨髓培养 3 d 后，，大部分细胞贴壁生长，形态呈椭圆形、多角形以及长梭见图 3.1A），6-7 d 时细胞 80%融合，大多数细胞呈现长梭形（见图 3.1B）。第 3 代，细胞整体呈长梭形，形态均一（见图 3.1C）。
图 3.2 流式细胞仪检测 BMSCs 的表面标志 CD44、CD45、CD90 和周期3.1.3 BMSCs 诱导分化为脂肪细胞经成脂诱导液诱导的第 3 代 BMSCs，细胞形态逐渐变圆，7d 左右脂滴出现逐渐变大。诱导 21d 后进行油红 O 染色，呈阳性（见图 3.3）。图 3.3 BMSCs 分化成脂肪细胞（油红 O 染色，Bar=100μm）3.2 六价铬致肾脏损伤模型的制备
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
【参考文献】
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2658966
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