孕哺期大鼠母体邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯暴露影响子代小脑颗粒细胞增殖与凋亡的机制研究

发布时间：2020-05-21 09:13

【摘要】：目的:邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di-(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)因其在塑料制品中的广泛应用以及在环境中的不易降解,成为了一种普遍存在的环境污染物。作为一种环境内分泌干扰物,DEHP在土壤,水体以及空气中均被发现,并可通过多种途径进入人体。流行病学报道孕期及哺乳期DEHP暴露会影响胎儿的神经发育,小脑是神经发育中重要的脑区,与机体的运动功能,协调性以及运动学习都有关,小脑颗粒细胞是小脑中数量最多且其正常发育是保证小脑功能的前提。但目前母体孕期和哺乳期暴露DEHP是否影响仔鼠小脑颗粒细胞的发育还不明确,其相关机制也有待研究。本研究通过在孕期及哺乳期通过灌胃的方式构建DEHP暴露模型,探讨妊娠期及哺乳期母体DEHP暴露对子代小脑颗粒细胞的增殖凋亡以及其相关行为学发育的影响,并探明其可能作用机制。研究方法:本研究以Wistar孕鼠和原代提取的小脑颗粒细胞为研究对象,首先将雌性 Wistar 大鼠随机分为四组:0 mg/kg/day,30 mg/kg/day,300 mg/kg/day和750 mg/kg/day DEHP暴露组。按着对应的剂量对其从怀孕第一天到仔鼠出生后21天进行DEHP灌胃构建DEHP暴露动物模型。利用气相色谱-质谱联用仪检测四个剂量组中怀孕第19天母鼠尿液中DEHP的五种代谢产物邻苯二甲酸单(2-乙基己基)酯(MEHP)、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-羟己基)酯(MEHHP)、邻苯二甲酸单(2-乙基-5-氧己基)酯(MEOHP)、邻苯二甲酸(2-乙基-5羧基戊基)酯(MECPP)和邻苯二甲酸(2-羧基甲基已基)酯(MCMHP)的含量,初步证明DEHP暴露动物模型是否成立。对其出生后各个时间段的仔鼠进行相应的小脑相关的神经行为学检测,包括平面翻正反射,负屈地性反射和抓力测试。在仔鼠出生后7天和14天,采用免疫荧光染色观察各组仔鼠小脑小脑颗粒细胞增殖的情况,并通过Realtime PCR和Western blot检测Shh信号通路中相关蛋白的表达。采用ELISA检测子代小脑内的雌激素水平以及Western blot检测芳香化酶的表达情况。此外在体内采用TUNEL检测各剂量组仔鼠在PN 7和PN 14天小脑颗粒细胞的凋亡水平,并通过Western blot检测各组仔鼠小脑颗粒细胞PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的表达情况。同时体外实验提取原代小脑颗粒神经元,建立原代小脑颗粒神经元MEHP暴露模型,采用CCK8检测MEHP对小脑颗粒神经元的耐受情况,并用TUNEL染色检测MEHP染毒后各组小脑颗粒神经元的凋亡水平以及采用免疫荧光染色检测其各剂量组的Cleaved caspase 3的表达情况;同时采用Western blot检测MEHP染毒后小脑颗粒神经元PI3K/Akt信号通路中相关蛋白的表达情况;并通过使用PI3K/Akt信号通路的激活剂IGF1以及抑制剂LY294002后检测各组小脑颗粒细胞的凋亡水平以及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的变化情况。结果:1、孕期及哺乳期DEHP暴露对仔鼠小脑体重以及小脑脏器系数的影响。于仔鼠PN 7和PN 14天取材并称量仔鼠体重以及小脑的重量,称量结果表明,各组仔鼠(雌性与雄性)其小脑重量以及仔鼠的体重均无统计学差异。2、DEHP暴露模型中母鼠尿液中DEHP主要五种代谢产物的浓度。气相色谱-质谱联用仪检测四个剂量组中怀孕第19天母鼠尿液中DEHP的五种代谢产物MEHP、MECPP、MEOHP、MEMHP和MEHHP的含量。结果显示对照组的五种DEHP代谢产物的含量均低于最低检测限,但随着染毒剂量的增加,这五种代谢产物的含量也随之增加,并呈剂量反应关系(P0.05)。这些结果表明我们成功建立了 DEHP暴露的动物模型。3、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞的增殖的影响。免疫荧光结果显示,在PN 7和PN 14天,与对照组相比,300 mg/kg/d与750 mg/kg/d DEHP暴露组中雄性仔鼠小脑外颗粒层颗粒细胞的增殖率(Pax6+PCNA+/Pax6+)显著下降(P0.05)。然而,对照组与 30 mg/kg/d DEHP暴露组之间仔鼠小脑颗粒细胞的增殖率并无明显差异(P0.05)。此外,对于雌性仔鼠其各组之间增殖率并没有明显的差异(P0.05)。4、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠神经行为发育的影响。在PN 3,PN 5和PN 7天,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠的平面翻正反射的时间均延长,且差异具有统计学意义(P0.05)。而雌性仔鼠的平面翻正反射时间在各组间无明显差异(P0.05)。对于抓力测试,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠仔鼠握杆时间与对照组相比显著减少(P0.05)。而雌性仔鼠的握杆时间在各组间无明显差异(P0.05)。此外,各组雌雄仔鼠前肢抓力实验时间均无明显差异。对于负趋地性反射实验,各个暴露组的雌雄仔鼠由头朝下转变到头朝上即旋转180°所需的时间均无明显差异(P0.05)。5、孕期及哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞Shh信号通路的影响。Real time RCR结果显示,在PN 7和PN 14天,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1基因水平显著下降(P0.05)。Western blot结果同样说明,在各个时间点,300与750 mg/kg/d DEHP暴露组的雄性仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1蛋白表达水平比对照组也明显降低(P0.05),然而对于雌性仔鼠,在PN 7和PN 14天各剂量暴露组之间的仔鼠小脑Shh,Gli1,N-Myc以及Cyclind1的mRNA水平以及蛋白的表达均无明显变化(P0.05)。6、孕期及哺乳期DEHP暴露对仔鼠小脑雌激素水平以及芳香化酶表达的影响。在各时间点暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑的芳香化酶的蛋白表达与对照组相比显著降低(P0.05),而雌性仔鼠的小脑的芳香化酶的蛋白表达在四个剂量组各个时间点均无明显差异(P0.05)。此外,ELASA结果显示,与对照组相比,暴露于300与750 mg/kg/d DEHP剂量组的雄性仔鼠小脑的雌激素水平也有明显下降(P0.05),同样,雌性仔鼠小脑的雌激素水平在四个剂量组各个时间点均无明显差异(P0.05)。7、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑颗粒细胞凋亡的影响。TUNEL结果显示300 mg/kg/d和750 mg/kg/d DEHP暴露组的雄性仔鼠的TUNEL阳性细胞率与对照组相比明显增加(P0.05),然而对雌性仔鼠的TUNEL阳性细胞率无明显影响(P0.05)。8、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑Total caspase 3以及Cleaved caspase 3蛋白表达的影响。在雄性仔鼠中,在PN 7和PN 14天,300 mg/kg/d和750 mg/kg/d DEHP暴露组中Cleaved caspase 3的表达水平明显高于对照组(P0.05),而Total caspase 3的表达水平与对照组相比却反而下降(P0.05)。对于雌性仔鼠各暴露剂量组间的Cleaved caspase 3的表达无明显差异(P0.05),Total caspase 3的表达也无明显差异(P0.05)。9、孕期与哺乳期母体DEHP暴露对仔鼠小脑PI3K/Akt信号通路的影响。Western Blot 结果显示,在 PN 7 和 PN 14 天,300 mg/kg/d 和 750 mg/kg/d DEHP暴露组雄性仔鼠小脑组织中的p-PI3K,p-Akt和Bcl-2水平与对照组相比显著下降(P0.05),而Bax的蛋白表达却明显上升(P0.05),各组雄性仔鼠小脑中PI3K,Akt蛋白表达无明显差异(P0.05)。各剂量暴露组中雌性仔鼠的小脑中PI3K/Akt信号通路中相关蛋白水平均无明显变化(P0.05)。10、MEHP对小脑颗粒神经元活力的影响。CCK8结果显示随着MEHP染毒剂量和时间的增加,细胞活力随之下降。25 lμM MEHP处理原代提取的小脑颗粒细胞12 h和24 h后,并没有明显影响小脑颗粒细胞的活力,但25 μM的MEHP作用在小脑颗粒神经元48 h后细胞活力显著下降(P0.05)。此外,250 μM MEHP作用在小脑颗粒细胞24 h后,细胞活力与对照组相比大约下降了 20%,当1000 μM MEHP作用于细胞24h后,细胞活力下降了 50%。11、MEHP促进了原代小脑颗粒神经元凋亡。TUNEL染色结果显示随着MEHP染毒剂量的增加,小脑颗粒神经元TUNEL阳性细胞率随之增加(P0.05)。同时我们还发现,随着MEHP的浓度增大,小脑颗粒神经元Cleaved caspase-3阳性细胞数也随之增多(P0.05)。Western blot结果也显示,与对照组相比,MEHP染毒组的Cleaved caspase-3的蛋白水平明显增加(P0.05),而Total caspase-3的蛋白表达水平却反而下降(P0.05)。12、MEHP干扰PI3K/Akt信号通路蛋白分子的表达。结果显示,与对照组相比,小脑颗粒神经元MEHP染毒组中p-PI3K,p-Akt和Bcl-2的蛋白表达水平明显下降(P0.05),而Bax的蛋白表达水平明显增加(P0.05)。此外,在各个组中PI3K和Akt的蛋白表达水平无明显差异(P0.05)。13、IGF1通过激活PI3K/Akt信号通路降低小脑颗粒细胞的凋亡,LY294002通过抑制PI3K/Akt信号通路加重了 MEHP诱导的小脑颗粒细胞的凋亡。MEHP单独处理组中的Bax和Cleaved caspase 3的蛋白表达水平增加(P0.05),而p-PI3K,p-Akt,Bcl-2和Totalcaspase3的蛋白表达水平明显降低(P0.05)。与MEHP单独处理组相比,IGF1与MEHP共同处理组中p-PI3K,p-Akt,Bcl-2 和 Total caspase 3 的蛋白水平明显增加(P0.05),而 Bax 和 Cleaved caspase3的蛋白表达水平降低(P0.05)。此外,在IGF1单独处理组与对照组之间,各蛋白的表达水平无明显差异。同时TUNEL结果显示,与MEHP单独处理组相比,预先给予IGF1的MEHP处理组中的TUNEL阳性细胞数明显减少(P0.05)。而在对照及IGF1单独处理组之间TUNEL阳性细胞数没有明显的差异(P0.05)。与对照组相比,DEHP与PI3K/Akt信号通路的抑制剂LY294002组一样可以抑制PI3K/Akt信号通路,且增加小脑颗粒细胞的TUNEL阳性细胞率(P0.05)。与LY294002单独处理组相比,MEHP与LY294002共同处理组的p-PI3K,p-Akt,Bcl-2和Total caspase 3的蛋白表达水平显著降低(P0.05),Bax和Cleaved caspase 3的蛋白表达水平明显增高(P0.05),且小脑颗粒细胞的TUNEL阳性细胞率也明显增加(P0.05)。结论:1、孕哺期DEHP暴露可通过下调Shh信号通路抑制雄性仔鼠小脑颗粒细胞的增殖,并导致神经发育障碍。2、孕哺期DEHP暴露可通过抑制PI3K/Akt信号通路诱导小脑颗粒细胞的过度凋亡。3、DEHP损伤小脑颗粒细胞的性别差异性可能与仔鼠小脑内雌激素水平以及芳香化酶表达有关。
【图文】：

仔鼠,小脑,体重,代谢产物

称量结果如图表明，，各组仔鼠（雌性与雄性）其小脑重量以及仔鼠的体重均无统计学差异（图3.1）。图 3.1 仔鼠体重与小脑重注：仔鼠体重与小脑重均以 mean±SEM 表示（n=8）。3.2 母鼠尿液中 DEHP 主要五种代谢产物的浓度MEHP，MECPP，MEOHP，MEMHP 和 MEHHP 是 DEHP 暴露的生物标志物，代表着尿液中 DEHP 代谢产物的主要组成部分。我们采用气相色谱-质谱联用仪检测四个剂量组中 GD 19 天母鼠尿液中 DEHP 的五种代谢产物的含量。如图 3.2 所示，对照组的五种 DEHP 代谢产物的含量均低于最低检测限。此外我们发现与对照组相比，DEHP 暴露组中 MEHP、MECPP、MEOHP、MEMHP 和MEHHP 都显著增高（P<0.05），且随着染毒剂量的增加，这五种代谢产物的含量也随之增加。

小脑颗粒细胞,尿液,对照组,浓度

图 3.2 母鼠尿液中 DEHP 五种主要代谢产物的浓度*P<0.05，与对照组相比；#P<0.05，与 30 mg/kg/d DEHP 暴露组相比；&P<0.05，与/kg/d 暴露组相比.3 孕哺期 DEHP 暴露对仔鼠小脑颗粒细胞增殖的影响Pax6 被认为是小脑颗粒细胞前体的标记物，对小脑颗粒细胞的正常发着重要作用[36]。PCNA 是细胞周期中 DNA 合成阶段表达于细胞核的增殖37]。因此，Pax6+PCNA+被标记于处在增殖的小脑颗粒细胞前体中，Pax6+PC标记于未处于增殖状态的小脑颗粒细胞中。为了探究 DEHP 暴露对小脑胞增殖的影响，我们分别计数了小脑外颗粒层中 Pax6+PCNA+与 Pax6+PC胞的数量，我们发现与对照组相比，300 mg/kg/d 与 750 mg/kg/d DEHP 暴雄性仔鼠小脑外颗粒层颗粒细胞的增殖率（Pax6+PCNA+/Pax6+）在 PN 7）和 PN 14（图 3.5）显著下降（P<0.05）。然而，对照组与 30 mg/kg/d D
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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