雌激素受体α下调介导十溴联苯醚破坏肌动蛋白微丝束致大鼠血睾屏障损伤的研究

发布时间：2020-05-25 02:37

【摘要】：目的十溴联苯醚(decabromodiphenyl ether,BDE-209)是一种具有持久性和生物累积特性的环境污染物,近年来在世界各地的环境、野生动物和人体内均检测出其存在。BDE-209对人体健康主要包括神经和神经发育、免疫、胚胎、生殖、致畸性和(潜在)致癌性等损害,其中雄性生殖毒性日益受到关注。BDE-209可以破坏血液-睾丸屏障(blood-testis barrier,BTB)结构影响精子发生,但机制尚不清楚。本课题通过体内和体外实验,探讨雌激素受体α(estrogen receptor alpha,ERα)在BDE-209破坏大鼠BTB结构中的分子机制。方法体内实验使用60日龄SPF级SD雄鼠,随机分为四组(溶剂对照组,0.1 mg/kg BW BDE-209组,0.5 mg/kg BW BDE-209组,2.5 mg/kg BW BDE-209组)。大鼠染毒采用睾丸注射法,12.8天后使用颈椎脱臼法处死并取材。体外实验使用18-20日龄SPF级SD雄鼠原代睾丸Sertoli细胞。细胞培养72 h后进行BDE-209剂量和时间趋势染毒,染毒剂量分别为12.5、25、50μM,染毒时间分别为6 h、12 h、24 h、36 h、48 h,筛选最适宜的染毒剂量和时间进行PPT处理。分别设五个处理组:DMSO组、PPT组、BDE-209组、BDE-209+PPT组、MPP组,染毒时间为24 h。进行以下实验:(1)为观察BDE-209对SD雄鼠和原代Sertoli细胞的毒作用,BDE-209染毒后计算大鼠睾丸脏器系数,HE染色和PAS染色法观察BDE-209睾丸注射后SD雄鼠睾丸和各期曲细精管形态学损伤,MTT试验检测不同浓度染毒组细胞活力。(2)为观察BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞中ERα表达的影响,采用qRT-PCR和WB试验检测ERαmRNA和蛋白表达。(3)为观察BDE-209染毒致SD雄鼠和原代Sertoli细胞BTB相关结构和功能改变,采用超微电镜观察大鼠睾丸BTB结构,采用qRT-PCR、WB和免疫荧光染色方法检测BTB相关蛋白的mRNA、蛋白和位置表达。(4)为阐明ERα在BDE-209破坏原代Sertoli细胞BTB结构中的作用,采用qRT-PCR、WB和免疫荧光染色方法检测ERα特异性激动剂PPT与BDE-209共处理后BTB相关蛋白的mRNA、蛋白和位置表达。结果 (1)BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞的毒作用。与对照组相比,各剂量组大鼠睾丸重量均减小(P0.05),0.5、2.5 mg/kg BW剂量组睾丸系数减小(P0.05)。HE染色观察各剂量组管腔内出现嗜酸性颗粒和未成熟精细胞、支持细胞空泡化、长型精子嵌入内皮、间质炎性细胞浸润和各级精细胞数目减少或缺失。PAS染色可见I-XIV期各期曲细精管内均出现上述损伤。随染毒浓度和时间增加,Sertoli细胞活力逐渐下降,与对照组相比,当BDE-209浓度超过50μM时差异有统计学意义(P0.05)。(2)BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞中ERα表达的影响。与对照组相比,2.5 mg/kg BW剂量组大鼠睾丸组织中ERα的mRNA和蛋白表达下降(P0.05)。与对照组相比,原代Sertoli细胞50μM和24 h、36 h、48 h染毒时ERα蛋白表达下降(P0.05)。(3)BDE-209染毒对SD雄鼠和原代Sertoli细胞BTB相关结构和功能影响。BTB超微电镜显示,2.5 mg/kg BW剂量组紧密连接出现明显断裂甚至解体,肌动蛋白微丝束出现缺失,支持细胞内出现脂滴和大量空泡。动物实验中,与对照组相比,ZO1、Occludin、β-catenin和Formin1在各剂量组mRNA表达均下降(P0.05);N-cadherin、Eps8在2.5 mg/kg BW剂量组mRNA表达下降(P0.05);与对照组相比,染毒组ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表达下降(P0.05)。原代Sertoli细胞中,与对照组相比,Occludin和β-catenin mRNA表达下降(P0.05);与对照组相比,染毒组ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表达下降(P0.05);时间趋势染毒结果显示,ZO1、Occludin、Eps8和Formin1在24 h、36 h、48 h染毒后蛋白表达下降(P0.05)。免疫荧光实验显示,随着染毒时间增长,12 h以后,F-actin排列稀疏,出现截断或排列紊乱。2.5 mg/kg BW染毒组可见BTB相关蛋白表达强度减弱,且紧紧围绕胞核,不再定位于细胞表面。(4)PPT缓解BDE-209对原代Sertoli细胞ERα表达和BTB结构的影响。BDE-209处理后,Occludin和β-catenin mRNA表达下降(P0.05),且与BDE-209组相比,PPT和BDE-209共处理组Occludin和β-catenin mRNA表达上升(P0.05)。与BDE-209组相比,共处理组ZO1、Occludin、Eps8和Formin1蛋白表达均上调(P0.05)。与BDE-209组相比,共处理组BTB相关蛋白表达有恢复趋势,Formin1可见排列整齐的微丝束。结论 DE-209染毒会引起SD雄性大鼠睾丸和原代支持细胞中ERα表达下调和BTB结构破坏,并引起睾丸形态学损伤。PPT处理可以恢复BDE-209染毒后ERα和BTB相关蛋白表达下调,提示雌激素受体α介导BDE-209引起的BTB结构损伤。为进一步了解BDE-209引起精子发生障碍、诱导雄性生殖损伤的分子机制,寻找筛选雄性生殖损伤的敏感效应标志物,防治BDE-209类环境内分泌干扰物的雄性生殖功能损伤提供科学依据。
【图文】：

示意图,动物,示意图,睾丸

图 1 动物处理示意图Fig 1 The schematic of animals treatment2.2.2 原代 Sertoli 细胞处理（1）睾丸原代 Sertoli 细胞提取。18-20 日龄 SPF 级雄鼠幼崽 10 只，颈椎脱臼法处死后，75%酒精浸泡 5 min，转移至细胞间操作台，使用灭菌剪刀和镊子摘取双侧睾丸，置于预冷灭菌 PBS 中浸泡 10 min，剥离睾丸白膜和血管，使用无菌剪刀将组织剪成约 1 mm3碎块，转移至 PBS 中轻轻搅拌以去除血细胞，静置 10 min，弃上清，重复一次洗涤一次后转移到离心管中。按每只睾丸加入 3 ml 0.25%胰蛋白酶（含 0.05 mg/ml DNase），37℃下 100 r/min 振荡消化 15-20 min 以释放 Leydig细胞，待组织块呈羽毛状混悬，加入含胎牛血清（FBS）的 F12/DEME 培养基终止消化，1000 r/min 离心 5 min，弃上清，，无血清 F12/DEME 重悬，重复一次。按每只睾丸加入 3 ml 含 0.1%胶原酶、0.1%透明质酸酶、0.05 mg/ml DNase 的消化液，

示意图,示意图,处理组,剂量

别为 6 h、12 h、24 h、36 h 和 48 h，筛选最适宜的染毒剂量和时间以便剂处理。分别设五个处理组：DMSO 组、PPT 组、BDE-209 组、BDE-209MPP 组，染毒时间均为 24 h。实验处理如下图所示。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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