突触素Ⅰ结构与丙烯酰胺神经毒效应关系研究

发布时间：2020-05-30 11:46

【摘要】：目的:丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种从水合丙烯腈中萃取并规模使用的乙烯基单体[1]。常温下通常以固体结晶的形式存在,颜色呈白色,主要用于生产聚丙烯酰胺,其聚合物(聚丙烯酰胺)常作为絮凝剂用于处理污水和废水或作为粘合剂用于造纸和纺织工业[2]。同时,聚丙烯酰胺在化妆品生产、矿石加工、染料、生物实验(如凝胶色谱和凝胶质谱)中也得到广泛应用。近年来在高温烹炸的食物中也发现其存在,且产生数量跟温度、水分以及烹炸时间均有联系。2002年,瑞典国家食品管理局和斯德哥尔摩大学的研究人员发现,丙烯酰胺在油炸和烧烤食品中的含量超过饮用水规定限值的500倍[1,3-5]。体细胞和生殖细胞实验结果提示ACR是一种神经毒物、致畸物以及致突变物[6,7]及可能的人类致癌物(IARC,1994)。其中,人类流行病学调查已明确ACR对人体的神经毒性:从事聚丙烯酰胺生产、使用的中毒病例具有明显的神经中毒毒性症状和体征,如四肢无力、共济失调、肢端痛觉过敏、震动觉和位置觉减退等。突触素Ⅰ(synapsinⅠ,SynⅠ)是定位于中枢和周围神经系统神经末梢突触前膜上的特异性磷酸蛋白,是神经递质释放调节网络上的关键蛋白。SynⅠ也是当前神经研究方向的热点话题,如阿尔兹海默症、帕金森氏症以及小脑萎缩症等神经退行性病变所致疾病均涉及到Syn Ⅰ蛋白的参与。前期研究发现,SynⅠ蛋白正是ACR所致神经毒作用机制中的关键功能蛋白之一,在ACR所致神经损伤中发挥着重要作用[8-10]。进一步的研究发现,ACR主要通过信号转导通路途径起作用,其中MAPK、PKA、NF-KB、AP-1和CaMKⅡ则是主要的信号因子,在Ca2+存在的情况下通过间接信号转导通路调控SynⅠ蛋白磷酸化水平的变化,影响神经递质的释放,从而引起后续神经毒效应的发生和发展[11,12]。ACR是否通过直接结合Syn Ⅰ蛋白发挥其神经毒效应尚无确切的证据。以上述实验结果为理论导向,本研究拟通过理论模拟方法对ACR与SynⅠ结合的可能性进行定量的计算和分析,为关键功能蛋白SynⅠ毒效机制的深入探讨提供依据,揭示初步的蛋白构象层面变化的研究数据支撑。本研究主要利用Dock半柔性对接和分子动力学模拟等方法构建ACR与蛋白质的相互作用模式,通过观察蛋白质与ACR作用前后的三维结构变化以及对接位点等构象位置信息,探究ACR对关键功能蛋白SynⅠ的可能效应机制,也为后续的损伤逆转和损伤保护等提供理论和技术的新视角。方法:1.同源建模法:使用Swiss-Model在线服务器,通过目标序列与模板序列的匹配、比对结果校正、主链生成、环区建模、侧链的安装和优化以及模型优化等几个过程模建基于大鼠源性的Syn Ⅰ蛋白,用于后续的理论模拟,为Dock分子对接提供蛋白质初始结构;2.Dock方法:采用USCF Chimera模块构建小分子ACR的三维结构并进行能量优化操作。采用Dock Prep模块添加氢原子、Syn Ⅰ蛋白的AMBER ff14SB力场及ACR的AM1-BCC的电荷。分子对接过程的半柔性对接操作均在Dock 6.7程序中运行,得到ACR与SynⅠ蛋白对接的Grid打分。Dock分子对接可以获得Syn Ⅰ和ACR的半柔性对接结果,同时也为后续的分子动力学模拟提供初始结构;3.分子动力学模拟:分子动力学模拟所需的初始结构由分子对接结果提供,所有准备和模拟工作均在AmberTools15中完成。体系经过分子动力学能量优化等常规步骤达到平衡。分子动力学模拟结果可获得SynⅠ和ACR柔性对接结果,同时提供SynⅠ蛋白结合前后构象比对结果。结果:1.Dock分子对接:结果表明,在三种结合模式中,ACR均与Ca2+发生配位结合。在体系Ⅰ(Pose 1)中,ACR位于口袋下方,与Ca2+形成2.4A的配位键,与周围氨基酸残基无明显的相互作用;在体系Ⅱ(Pose 2)和Ⅲ(Pose3)中,ACR位于口袋上方,与Ca2+分别形成2.3A和2.4A的配位键,且分别与Glu373形成3.4A的氢键作用与Lys225形成3.2A的氢键作用;2.分子动力学模拟:采用分子对接方法获得小分子ACR与SynⅠ蛋白的初始结合构象,经过30ns的分子动力学模拟,得到3种不同的结合模式-体系Ⅰ和体系Ⅱ与体系Ⅲ。从能量上看,小分子结合在体系Ⅰ的区域内相对牢固、稳定,结合力强,因此,小分子很有可能以这种方式结合到SynⅠ蛋白中,进一步导致其结构和功能的改变,进而产生后续的毒效应。从结构上看,体系Ⅱ和体系Ⅲ都趋向于同一种结合模式,说明该类型模式具有一定的优势;3.通过对比ACR分子与SynⅠ结合前后的构象变化发现:1)小分子以模式Ⅰ方式结合在蛋白质口袋时,会引起Ca2+附近的环区(loop)和β-折叠((β-sheet)发生构象变化(其中左侧环区外翻),并进一步引起更远的α-螺旋(α-helix)结构发生位移。在该模式中,ACR虽未结合在Ca2+口袋,但通过影响口袋附近的区域结构影响活性口袋的形状,从而影响Ca2+、ATP的结合;2)在模式Ⅱ和Ⅲ中,ACR结合在Ca2+口袋中,仅引起环区的构象变化,并未改变β-折叠和α-螺旋的构象,对蛋白质构象变化的影响较小。结论:1.Dock对接结果显示,SynⅠ蛋白与ACR可以通过某些形式直接结合发挥相应功能,但是Ca2+在其中发挥重要作用。模式Ⅱ和Ⅲ均与Ca2+以三元复合物的形式结合,且相应的结合位点为Glu373和Lys225。结果表明Syn Ⅰ蛋白与ACR在Ca2+存在的情况下可发生直接结合作用;2.分子动力学模拟结果显示,从能量上看,小分子结合在体系Ⅰ的区域内相对牢固、稳定,结合力强,因此,小分子很有可能以这种方式结合到SynⅠ蛋白中,进一步导致其结构和功能的改变,进而产生后续相应的毒效应。从结构上看,体系Ⅱ和体系Ⅲ都趋向于同一种结合模式,说明该模式有一定优势。根据分析,小分子以体系Ⅱ和Ⅲ形式结合到Syn Ⅰ蛋白的可能性较大,即Asp313、Arg315、Arg328和Ile395等氨基酸残基可能是ACR结合到Syn Ⅰ蛋白的结合位点。通过对比ACR分子与Syn Ⅰ蛋白结合前后的构象变化发现Syn Ⅰ蛋白在与ACR发生相关作用后,会导致其结构发生变化。3.本研究应用计算理论模拟方法探索Syn Ⅰ蛋白结构及其与丙烯酰胺的相互作用,在原子水平评估ACR直接结合SynⅠ蛋白的关键作用位点的损伤机制,从而为后续Syn Ⅰ蛋白的结构解析实验提供一定的理论依据,并为ACR直接结合Syn Ⅰ蛋白发挥其神经毒效应的机制研究奠定科学基础。
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