LRRK2在锰神经毒性中的作用及调控机制

发布时间：2020-05-31 12:54

【摘要】：背景锰是参与蛋白、脂质合成的必需微量元素之一,是多种酶蛋白的辅因子。正常状况下,人们从饮食中即可摄入足够的锰。锰在人体过量聚集会导致锰中毒,而对其神经系统的毒性效应一直是研究关注的热点问题。过量锰暴露能诱导黑质多巴胺能神经元的损伤,引起类帕金森氏症的临床症状。小胶质细胞活化在锰诱导的神经毒性中发挥重要作用,前期的研究显示,锰神经毒性可能与小胶质细胞活化,进而通过神经炎症反应诱发神经元损伤有关;抑制小胶质细胞的活化能部分缓解锰的神经毒性作用,而其中的具体机制尚不完全明确,因此,尽早发现调控小胶质细胞功能的关键分子有可能在锰神经毒性的研究中开辟新的领域。LRRK2是一种多结构域的亮氨酸激酶,主要分布在细胞质及线粒体外膜中。LRRK2富含亮氨酸重复(LRR)结构域、激酶结构域、DFG样基序、RAS域、GTP酶域、MLK域和WD40等多种结构域,在调控神经系统功能中发挥重要作用。已证实多种神经退行性疾病的发病机制,包括帕金森氏症和克罗恩病,都与LRRK2的突变有密切关系。新近研究发现,LRRK2不仅在神经元中发挥重要作用,在调控小胶质细胞的生理功能中也发挥了重要功能。LRRK2在小胶质细胞中存在高表达,且抑制LRRK2的表达能显著抑制小胶质细胞的活化功能。前期芯片结果提示,锰暴露后能显著引起体内LRRK2表达的改变,而其中的具体机制尚不明确。本课题试图发现LRRK2在锰诱导的神经毒性及小胶质细胞活化中是否发挥重要作用,为揭示锰神经毒性的具体机制提供新的理论依据。LRRK2是一种多结构域的亮氨酸激酶,主要分布在细胞质及线粒体外膜中。LRRK2富含亮氨酸重复(LRR)结构域、激酶结构域、DFG样基序、RAS域、GTP酶域、MLK域和WD40等多种结构域,在调控神经系统功能中发挥重要作用。已证实多种神经退行性疾病的发病机制,包括帕金森病和克罗恩病,都与LRRK2的突变有密切关系。新近研究发现,LRRK2不仅在神经元中发挥重要作用,在调控小胶质细胞的生理功能中也发挥了重要功能。LRRK2在小胶质细胞中存在高表达,且抑制LRRK2的表达能显著抑制小胶质细胞的活化功能。前期芯片结果提示,锰暴露后能显著引起体内LRRK2表达的改变,而其中的具体机制尚不明确。本课题试图发现LRRK2在锰诱导的神经毒性及小胶质细胞活化中是否发挥重要作用,为揭示锰神经毒性的具体机制提供新的实验依据。自噬参与多种生理过程,在维持细胞正常活动中发挥着重要作用。近年来的研究发现,小胶质细胞自噬功能在调控小胶质细胞的炎性反应中发挥重要作用。LRRK2在调控细胞自噬功能中发挥巨大作用,小胶质细胞自噬体膜结构上存在LRRK2的结合位点,提示LRRK2可能通过调控小胶质细胞自噬进而影响小胶质细胞的活化。前期研究发现,锰暴露通过诱导小胶质细胞自噬功能紊乱,加剧小胶质细胞的炎症反应。那么LRRK2是否通过调控小胶质细胞自噬及相关信号通路,进而参与对锰神经毒性的影响,尚未见报道。因此,本研究试图发现自噬及相关通路在锰诱导的小胶质细胞活化及LRRK2改变中的具体作用,研究结果有可能为治疗和防护锰神经毒性提供新的理论依据。目的本研究拟通过建立体内、外锰暴露模型,验证锰暴露对小胶质细胞神经炎症反应的影响;通过体内体外实验,检测锰暴露后小胶质细胞中LRRK2的表达情况;通过干预LRRK2的表达,检测LRRK2在锰诱导小胶质细胞神经炎症反应中的具体作用;通过检测锰暴露后自噬蛋白及信号通路的表达,探究自噬及信号通路在锰诱导LRRK2表达改变中的具体作用,研究结果将为防治锰神经毒性提供新的思路和依据。方法1.建立模型1)动物模型:C57BL/6小鼠分为对照组、锰暴露组、LPS阳性对照组。给药方式为皮下注射,剂量为对照组0.9%NaCl,锰暴露组100 mg/kg MnCl_2,LPS组1 mg/ml LPS,给药时间:隔天注射一次,共注射3次。2)细胞模型:BV2小胶质细胞,锰浓度为100μmol/L,LPS浓度为1μg/ml,刺激时间24 h。2.采用原子吸收分光光度计法检测小鼠血锰、脑锰含量。行为学实验验证锰暴露对运动能力的影响;免疫组织化学染色、Western blot检测锰暴露后体内TH蛋白的变化;免疫组织化学染色、Western blot、qPCR、ELISA检测体内外模型锰暴露后小胶质细胞的形态变化及炎性因子的表达水平。3.运用免疫荧光染色、Western blot和qPCR技术检测体内、外锰暴露模型中LRRK2的表达情况;运用siRNA干扰技术、抑制剂、腺病毒多种检测方法观察抑制LRRK2后锰诱导小胶质细胞炎症因子的表达变化;通过脑立体定位注射LRRK2低表达病毒,观察锰暴露后小鼠运动能力及相关蛋白的改变情况。4.运用免疫荧光染色、透射电镜、Western blot和qPCR等技术检测体内、外锰暴露模型中自噬相关分子的表达变化;通过多种手段干预LRRK2的表达,观察自噬相关分子的表达情况;运用Western blot检测LRRK2与AMPK、mTOR信号通路之间的相互作用,利用相应蛋白的特异性抑制剂,观察信号通路相关蛋白的对LRRK2表达的影响。结果1.锰暴露能够诱导小胶质细胞活化并引起神经炎症反应体内原子吸收结果显示,与对照组相比,染锰组的血锰、脑锰值显著增高(P0.05);旷场实验、爬杆实验结果均显示染锰组小鼠的运动能力显著下降。免疫组织化学染色结果表明,锰暴露能够引起黑质、纹状体区TH蛋白的表达量减少、Iba-1、CD68阳性细胞比例明显增加(P0.05);Western blot、qPCR结果显示,体内、外锰暴露均能够引起炎症相关分子的表达增加(P0.05);ELISA结果进一步证实锰暴露能够诱导炎症因子的表达增加(P0.05)。2.LRRK2在锰诱导小胶质活化及神经炎症反应中的作用Western blot、免疫荧光染色结果显示锰暴露能够显著增加黑质、纹状体中LRRK2的表达量(P0.05);免疫荧光染色结果表明,锰暴露能够引起BV2细胞中LRRK2阳性细胞比例增加(P0.05);Western blot、qPCR结果证明锰暴露能显著增加BV2细胞中LRRK2的表达(P0.05);通过LRRK2抑制剂、AV-LRRK2腺病毒及siRNA-LRRK2技术,结果发现抑制LRRK2表达能显著抑制BV2细胞中炎性因子的表达(P0.05);立体定位注射AAV-LRRK2病毒,降低体内LRRK2的表达能显著抑制锰暴露对小鼠运动能力的影响(P0.05);Western blot结果提示降低体内LRRK2的表达能减少锰暴露对TH蛋白影响,并显著抑制锰暴露导致的小胶质细胞活化;结果提示LRRK2在锰暴露诱导的小胶质细胞活化中发挥了重要作用。3.自噬及信号通路在锰暴露诱导LRRK2改变中的作用Western blot、qPCR结果发现,锰暴露后能增加体内、外自噬相关分子的表达(P0.05);透射电镜可观察到锰暴露后自噬泡数目显著增多(P0.05);通过LRRK2抑制剂、AV-LRRK2腺病毒及siRNA-LRRK2技术,抑制LRRK2表达能显著抑制BV2细胞中自噬相关蛋白及mRNA的表达(P0.05);Western blot结果提示锰暴露能够显著减少小鼠黑质、纹状体中mTOR磷酸化水平(P0.05),同时增加AMPK的磷酸化水平;抑制LRRK2能显著抑制锰对mTOR磷酸化的影响(P0.05);抑制LRRK2不能改变锰暴露对AMPK磷酸化水平的影响,而加入AMPK抑制剂能显著抑制锰的毒性作用和LRRK2的改变。结论综上所述,本课题的研究率先发现LRRK2是锰诱导小胶质细胞炎症反应的重要原因;降低LRRK2的表达可能对锰诱导小胶质活化起到抑制作用,从而减轻锰神经毒性作用;LRRK2是通过调控小胶质细胞自噬功能,导致小胶质细胞的功能障碍;AMPK信号通路和mTOR信号通路可能是锰调控自噬的关键信号通路。
【图文】：

多巴胺神经元,自噬,神经炎

空军军医大学博士学位论文子激活烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶和诱导型一氧OS）后，导致活性氧物质和一氧化氮（NO）的形成[39, 40]。活化的有吞噬特性及神经免疫性功能，对于 CD200 / CD200R、CD47 / C化因子配体 1 及其受体（CX3CL1 / CX3CR）的表达具有一定的调节蛋白和补体系统的成分（C1q 和 C3）。此外还可以清除细胞碎片元[41]。转录因子如核因子 κB（NF-κB），STAT1、STAT3 和 SMAD行性疾病中表达上调，进而导致小胶质细胞活化，并造成神经炎症此过程中自噬发挥怎样的作用，神经炎症反应造成多巴胺能神经元制尚不清楚。自噬促进基因 ULK1（unc-51 如自噬激活激酶 1）是哺素靶标复合物 1（mTORC1）的负调节器，通过与 mTOR 蛋白的相胞的生存[42]。

小胶质细胞,类型,小胶质

图 2 小胶质细胞的活化类型[62]导小胶质细胞活化的调节机制近的研究发现锰对小胶质细胞的活化作用受多种信号通路的调控示，锰诱导小胶质活化通过激活 NF- B 和 MAPK p38 信号通路[71究显示锰诱导的小胶质细胞活化与 AP-1 密切相关[72]。除了 p38，另激酶，ERK 和 JNK 也在锰诱导神经炎性反应中起到重要作用[73, 7锰能增加 I B- 的抑制分子，从而激活 NF- B[75]，同时，锰能通路促进 I B- 的磷酸化。另有研究显示锰能激活 MAPK 的上/6, MKK-1/2, 和 MKK-4[76]。锰暴露能特异性降低 MAPK 的负向调76]。之前的结果提示，NF- B/MAPK/AP-1 通路在锰诱导小胶质活作用。课题组最近的研究发现自噬在调节锰神经毒性及小胶质细胞键作用。动物实验发现急性或慢性锰暴露均能引起黑质区自噬相
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114

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