三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的机制研究

发布时间：2017-03-26 15:16

  本文关键词：三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨三氯乙烯(TCE)对人胚胎干细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。方法:以人胚胎干细胞H9体外心肌定向分化为基础,培养液中添加不同剂量的TCE(处理组分别为:100 ppb组,1 ppm组,10 ppm组)以及二甲基亚砜(DMSO,对照组)。对诱导后形成的拟胚体以及不同发育阶段的细胞进行检测:MTT法测定细胞生存力,直观统计拟胚体自主节律性搏动次数,流式细胞仪计数分析细胞分化比例,荧光定量PCR检测心肌特异性基因表达,免疫荧光法检测各个时期相关蛋白表达,基因芯片法观察TCE对心肌细胞钙离子通道相关基因表达的影响。结果:1.胚胎干细胞向心肌成功定向分化随着时间的推移,细胞依次经过多能干细胞期,拟胚体悬浮期以及自发节律性搏动的贴壁拟胚体形成期。可以观测到胚胎干细胞(ESC)形态发生变化,用阶段特异性标记物作RT-PCR,结果显示心肌细胞分化成功。2.TCE的细胞毒性作用MTT法显示,所检测的浓度对于未分化的胚胎干细胞和终末分化的心肌细胞的细胞活性均不产生明显的细胞毒性作用(n=12,P0.05)。说明所用剂量的TCE本身不影响细胞活性。3.TCE抑制人胚胎干细胞的心肌定向分化随着体外培养时间的延长,观测到的拟胚体搏动数目增加,自发搏动拟胚体发生的时间比对照组向后推移,流式细胞检测显示,随着TCE浓度增加,心肌特异性标志物cTnt的阳性率不断降低,表明TCE对于心肌分化的抑制具有明显的剂量依赖性。收集培养D21的各组剂量处理的细胞,用免疫荧光法检测cTnt蛋白表达,结果显示细胞受累区域明显增大。4.TCE抑制心肌分化阶段标志物的表达TCE对于多能基因Nanog、Tert和Sox2、中胚层形成相关基因Gata4和T的表达水平没有显著影响(P0.05)。但TCE能够显著影响成熟期心肌标志物cTnt和Mhy-7的表达水平,并呈现一定的剂量依赖性下调,说明TCE影响心肌细胞从心肌前体期到成熟心肌分化的转变。5.TCE对心肌钙离子通道相关基因表达的影响q-PCR结果显示钙离子通道相关基因Serca2和Cav1.2表达水平显著下调,说明TCE干扰心肌细胞钙离子通道基因的表达。将具有自主性节律搏动的心肌细胞进行芯片分析,发现这些能够自主搏动的细胞其钙离子通道相关基因的数目总体呈现下调。结论:三氯乙烯抑制心脏祖细胞向心肌细胞的分化过渡,降低成熟心肌分化的比例,干扰Ca2+通道相关基因的表达,造成心肌细胞分化发育障碍及其自发搏动低下。
【关键词】：三氯乙烯 人胚胎干细胞 心肌分化 基因表达 钙离子通道相关基因
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 引言10-16
• 实验材料与方法16-25
• 一.实验材料16-17
• （一）实验细胞16
• （二）主要试剂16-17
• （三）主要仪器17
• 二、实验方法17-25
• （一）饲养层细胞-MEFs（成纤维细胞）培养17-19
• （二）人胚胎干细胞培养和分化19-21
• （三）自发节律性搏动EBs的数量和搏动频率测定21
• （四）MTT测定细胞活性21-22
• （五）流式细胞分析分化比例22
• （六）免疫荧光检测心肌蛋白表达22-23
• （七）心肌分化基因表达检测23-24
• （八）心肌钙离子通道相关的基因表达检测24
• （九）统计分析24-25
• 实验结果25-32
• 一、胚胎干细胞向心肌定向分化25-26
• 二、TCE对细胞活性和心肌分化的影响26-29
• 三、TCE抑制心肌分化阶段标志物的表达29-30
• 四、TCE对心肌钙离子通道相关基因表达的影响30-32
• 讨论32-36
• 结论和展望36-37
• 参考文献37-44
• 综述44-58
• 参考文献53-58
• 缩略词表58-60
• 攻读学位期间公开发表的论文60-61
• 致谢61-62

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 张惠敏;三氯乙烯生产及应用现状[J];中国氯碱;2004年08期

  本文关键词：三氯乙烯抑制人胚胎干细胞向心肌分化的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：268998