血清中二恶英CBG2.8D生物检测的初步探索

发布时间：2020-06-20 02:30

【摘要】：研究目的:本研究旨在探索采用基于CBG2.8D细胞株的生物检测法检测少量血清内二恶英类化合物含量时的前处理方法,并完成对血清样本的检测以初步了解其适用性;验证不同水平二恶英类化合物暴露人群血清中差异显著的三种载脂蛋白表达量,并对暴露水平和蛋白表达量的关系进行讨论。研究内容与方法:1.采用不同浓度TCDD急性暴露的大鼠血清进行前处理方式的探索,进行多次实验以建立稳定有效的适合血清样本检测的生物学检测(CBG2.8D)方法。找到合适的检测流程方案后,选取天津市氯化工行业工人(共7组)的血清样本作为实验对象,利用CBG2.8D生物检测法进行检测分析,并将结果与已获得的高分辨气相色谱-高分辨质谱仪(HRGC-HRMS)的分析结果进行对比。2.用Western Blot技术对蛋白组学数据中筛选出的差异显著的三种载脂蛋白ApoCI、ApoCIII、ApoCIV进行验证并对表达量变化趋势进行讨论。研究结果:1.实验发现对于0.5mL的高二恶英浓度大鼠血清,采用正己烷和异丙醇的有机溶剂萃取法搭配酸性硅胶柱过柱的净化浓缩的方式进行前处理并采用CBG2.8D生物检测较为合适,人类血清样本的生物检测检测结果与高分辨结果差异较大。2.ApoCI、ApoCIII、ApoCIV的Western Blot的验证结果与血清蛋白组学研究结果趋势一致,ApoCI蛋白在T1组的表达水平比C1组的高66%,在T2组的表达水平比C1组高22%,在T3组的表达水平比C1组高82%,组间差异均具有统计学意义(P0.05);ApoCIII蛋白在T1组的表达水平比C1组低45%,在T2组的表达水平比C1组低62%,在T3组的表达水平比C1组低5%,组间差异均具有统计学意义(P0.05);ApoCIV蛋白在T1组的表达水平是C1组的14.57倍,在T2组的表达水平是C1组的11.0倍,在T3组的表达水平是C1组的14.84倍,组间差异均具有统计学意义(P0.05);研究结论:1.对于少量高二恶英浓度的大鼠血清样本,CBG2.8D生物检测较为适宜的前处理方式是正己烷和异丙醇的有机溶剂萃取法搭配酸性硅胶柱过柱的净化浓缩方法。其检测结果与高分辨检测法结果相近。对于氯化工厂工人的血清样本,CBG2.8D生物检测法的检测结果与HRGC-HRMS高分辨法的检测结果差异显著,不能认为来自同一总体。推测原因:(1)血清中某些非二恶英类化合物成分也会激活芳香烃受体通路产生响应,由于CBG2.8D生物检测法检测原理依赖的是AhR通路的激活,所以其结果直接表现为AhR通路的响应程度,而大鼠的培养及染毒环境基本完全可控,但是氯化工厂工人的生活环境更为复杂,暴露因素不完全可控,血清中可能含有其他未知的可激活AhR信号通路的物质,导致CBG2.8D生物检测法所推导出的血清内总TEQ与HRGC-HRMS高分辨法的检测结果差异较大。(2)由于本次研究使用的人类血清样本量较低(0.5mL),不能多次进行重复实验,可能会存在偏倚相对较大的情况,导致检测结果不具有相关性。如果进一步加大检测样本量,检测结果可能会有所改善。2.ApoCI、ApoCIII、ApoCIV在三个暴露组中均呈现出低暴露和高暴露组的蛋白表达量高于中暴露组;在暴露组和清洁对照组中,ApoCI、ApoCIV的表达量暴露组高于对照组,ApoCIII的表达量暴露组低于清洁对照组。ApoCI、ApoCIV是脂质代谢相关疾病发生的危险因素,ApoCIII是脂质代谢相关疾病发生的保护因素。由此可以推测,二恶英类化合物的暴露会增加某些脂质代谢相关疾病的发生率。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
【图文】：

图 1 酸性硅胶柱的装填示意品萃取液加入硅胶柱中，柱子下方用鸡心瓶盛接洗脱液，然洗串联柱，待柱中液面下降到硫酸钠层水平时，再次加入 10复此过程 3 次。盛有洗脱液鸡心瓶安装在旋蒸仪上进行浓缩，待瓶内液体蒸体转移至 GC 管进行氮吹，并用 1mL 正己烷润洗鸡心瓶后过程重复三次。：待氮吹至管内液面水平稳定后，加入 10μL 的 DMSO 定中避光冷藏保存。有机溶剂转换成 DMSO 时，必须将有机免有机溶剂对细胞的影响。理方案阅相关文献发现，酸洗法和复合层析柱与法均可以作为 CB前处理方式，且两种方式的检测值差异无统计学意义（P>0取后，分别采用酸性硅胶柱过柱和酸洗法两种方式进行前处，进一步对两者进行比较。处理步骤如图 2 所示：

图 2 血清前处理流程示意图鼠血清蛋白的变性：向 0.5mL 大鼠血清中加入 0.5mL 异丙醇，涡旋一分钟，大鼠血清与异丙醇充分混合，将血清蛋白完全变性沉淀。萃取：向混合液中加入 1mL 正己烷，涡旋一分钟，充分萃取血清中的脂质，置待分层后，取上清液，此过程重复三次。.样品的净化浓缩：性硅胶柱法：将上清液加入已经如图装填好的硅胶柱，并分三次加入 10mL 正烷洗脱。将洗脱液旋蒸氮吹，最后加入 10μlDMSO 定容备用。洗法：向上清液中加入 2mL 浓硫酸，充分震荡混合，静止后取上清液重复 3-5，目的是除去样品中的不稳定物质。向酸洗完毕后的溶液中加入 2M 的氯化钠液震荡水洗 3-5 次，目的是去除残余的 浓硫酸，最后将上清液分离，旋蒸氮，加入 10μlDMSO 定容备用。经过多次实验后发现，酸洗法由于使用的试剂浓硫酸酸性很强，多次洗涤

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