沉默Keap1基因对Nrf2相关基因表达的影响及在砷皮肤氧化应激损伤中作用

发布时间：2017-03-30 10:17

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【摘要】：目的:研究Keap1基因沉默对Nrf2相关基因表达在砷致皮肤细胞毒性中的作用,为砷致皮肤损伤提供理论依据。方法:1.慢病毒载体的构建。依据Keap1基因序列构建Keap1sh RNA,采用BamH I,EcoR I双酶切载体,T4ligase连接载体与目的基因,经感受肽细胞转化后,平板挑菌培养,菌液测序。2.慢病毒包装。阳性质粒大量抽提扩增,共转293T细胞,收集病毒上清,测定病毒滴度。3.构建沉默Keap1的HaCaT细胞系。不同的慢病毒载体(空载体、Keap1 shRNA1/2/3)分别感染HaCa T细胞,感染复数(MOI)为5,48小时后,1μg/ml嘌呤霉素筛选稳转株。4.稳转株的鉴定。培养上述经过筛选获得的稳转株,提RNA并定量,通过实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测细胞中Keap1 mRNA表达水平。5.采用MTT还原法检测细胞生长状况,确定LC50及染毒浓度,染毒浓度分别为LC50的1/100、1/50、1/10。6.流式细胞仪检测细胞的凋亡情况。7.RT-PCR检测细胞中Nrf2、Keap1、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表达水平。8.ELISA试剂盒检测细胞中GSH、HO-1、As3MT蛋白表达水平。结果:1.慢病毒干扰载体构建,经基因测序,显示与目的基因序列完全匹配。2.慢病毒滴度测试结果,为2×108TU/ml。3.建立的Keap1-KD稳转细胞株中sh1最好,其基因的沉默效率为71%,作为后续实验细胞。4.混合砷染毒模型细胞48h的LC50为290.00μmol/L,染毒浓度分别为LC50的1/100为2.90μmol/L,LC50的1/50为5.80μmol/L,LC50的1/10为29.00μmol/L。5.2.90μmol/L混合砷染毒促进细胞增殖,抑制细胞凋亡;随染毒浓度增加(5.80μmol/L-29.00μmol/L)染毒时间(48h、72h)延长增殖水平下降,凋亡率迅速上升。6.低剂量(2.90、5.80μmol/L)短时间(8h、24h)混合砷染毒促进模型细胞中Nrf2、Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA的表达,与对照组相比表达上调:高剂量(29μmol/L)长时间(72h)混合砷染毒抑制模型细胞中各基因的表达,与对照组相比表达下调,差异有统计学意义(P0.05)。7.低剂量(2.90、5.80μmol/L)短时间(24h、48h)混合砷染毒模型细胞能促进As3MT、GSH、HO-1蛋白的表达,随染毒浓度(29μmol/L)增加时间延长(72h),As3MT、GSH、HO-1蛋白的表达量有所下降,但仍远高于对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.混合砷染毒能改变细胞中增殖与凋亡的比率,低剂量促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,高剂量抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。2.混合砷染毒模型细胞,Nrf2高表达,随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因有下调趋势,但明显高于未转染组。3.混合砷染毒能使模型细胞中Bach1、MAPK/ERK、CBP、As3MT mRNA表达和As3MT、GSH、HO-1蛋白表达发生改变,随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因表达由上调趋势转为下调趋势。4.混合砷对模型细胞的毒性作用受时间和浓度交互作用的影响,可推测砷暴露随着染毒时间的延长,染毒浓度的加大对皮肤细胞的损害越严重。
【关键词】：亚砷酸钠 HaCaT细胞 细胞凋亡 基因表达 慢病毒
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-28
• 1.材料14-17
• 2.方法17-26
• 3.统计分析26
• 4.质量控制26-27
• 5 实验技术路线27-28
• 结果28-50
• 讨论50-58
• 小结58-59
• 致谢59-60
• 参考文献60-66
• 综述66-79
• 参考文献74-79
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文79-80
• 附件 1:基因测序结果80-81
• 导师评阅表81

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本文编号：276876