铜对H22荷瘤小鼠肿瘤的生长以及EGFR通路相关蛋白表达的影响

发布时间：2020-07-30 13:58

【摘要】：目的:通过建立H22荷瘤小鼠肝癌模型,观察适宜铜浓度对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的作用,并初步研究适宜铜浓度对H22荷瘤小鼠EGFR通路相关蛋白的影响,探讨铜促进肿瘤细胞增殖的机制。方法:选取SPF级昆明小鼠160只,随机分为对照组(水),对照组(水+四硫钼酸铵盐TM),加铜组(0.06,0.30,1.50 mg/kg)和铜+TM组(0.06+1,0.30+1,1.50+1 mg/kg),共8组。用不同浓度的硫酸铜溶液给小鼠灌胃4周,使小鼠体内获得铜蓄积。随后,将H22腹水瘤细胞接种于小鼠右腿部,建立H22肝癌小鼠移植瘤模型。再根据相应的分组及硫酸铜浓度继续持续灌胃4周。接种肿瘤以后,每三天记录肿瘤大小一次。8周后,处死小鼠,对移植瘤的发生率、大小及重量进行分析。收集相应器官(脾脏和胸腺)并根据公式计算脏器指数。全自动生化分析仪检测血清白蛋白(ALB)丙氨酸,丙氨酸氨基转移酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)。用ICP-MS检测小鼠血清中的铜浓度;用实时定量PCR(Real-timePCR)方法检测肿瘤组织VEGF、bFGF和c-Myc的mRNA的表达水平。用Western blot检测磷酸化EGFR(pEGFR)和磷酸化Erk1/2(pErk1/2)蛋白水平。免疫组化法检测EGFR和c-Myc蛋白水平。所有数据均用SPSS软件处理。结果:小鼠H22移植瘤的发生率达100%;与对照组(水)和铜+TM组相比,加铜组的肿瘤均有不同程度的增长,且呈剂量反应关系;各组小鼠的肝功能指数谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)和白蛋白(ALB)之间没有统计学差异(P0.05);小鼠的脾脏指数和胸腺指数结果显示各组之间没有统计学差异(P0.05);ICP-MS检测小鼠血清铜结果显示,随着不同的灌胃剂量的增加,小鼠体内的血清铜含量不断增加,且相应的铜+TM组的血清铜低于加铜组,各组之间的差异具有统计学意义(P0.05),血清铜浓度与肿瘤重量之间的相关分析结果显示,两者之间具有相关性(r=0.316,P0.05);加铜组的VEGF、bFGF和c-Myc的mRNA的表达量均上升,且各组之间的差异具有统计学意义(P0.05)。此外,在肿瘤组织中,加铜组与相应的铜+TM组相比显示,EGFR、pEGFR、pErk1/2和c-Myc蛋白的表达均被上调。结论:适宜的铜浓度能促进H22移植瘤小鼠肝肿瘤的生长,TM对肿瘤生长也有抑制作用,且本实验所用的铜灌胃剂量是在机体的允许范围内,未对机体的肝脏和免疫系统造成影响。相应蛋白的表达改变提示铜促进肿瘤生长的机制可能是通过EGFR信号通路,这需要进一步的深入研究。这些证据为肝癌的预防提供了依据,同时也为防治铜污染提供了证据。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
【图文】：

信号通路

Cu对EGFR信号通路的调节

标准曲线,标准曲线,制胶,分离胶

3）将 200 uL BCA 工作液加入以上各孔。（37℃，30 min）4）用酶标仪测得的吸光度数据拟合蛋白标准曲线，再通过样本孔吸光度数据计算相应样本的蛋白浓度（。图2 为本实验BCA法得到的蛋白浓度标准曲线）。图 2 蛋白浓度标准曲线10.3 Western-blot 检测 pEGFR 和 pErk1/2 蛋白（1）制胶1）清洗玻璃板后再用蒸馏水冲洗晾干备用。2）制胶a 8% 分离胶的配制（12 mL）：dd H2O：5.5 mL30%丙烯酰胺： 3.3 mLPH8.8 Tris ：3 mLSDS：120 μL过硫酸铵：120 μLTEMED ：7.2 μLb 15% 分离胶的配制（12 mL）dd H2O ：2.8 mL30%丙烯酰胺混合液： 6 mLPH8.8Tris ：

趋势图,荷瘤小鼠,低铜,高铜

图 3 H22 荷瘤小鼠模型各组肿瘤平均体积的变化趋势A 组：对照组（水）；B 组：对照组（水+TM）；C 组：低铜组（0.06 mg/kg）；D 组：低铜+TM 组E 组：中铜组（0.30 mg/kg)；F 组：中铜+TM 组；G 组：高铜组（1.50 mg/kg）；H：高铜+TM 组

【参考文献】