高分辨质谱结合组学技术在3-MCPD酯肾毒性早期诊断中的应用

发布时间：2020-08-01 20:04

【摘要】：近年来,食品加工过程诱导产生的污染物3-氯-1,2-丙二醇脂肪酸酯(3-MCPD酯)的肾毒性引起了广泛关注。但是其作用机制尚不明确,并且尚无早期诊断其肾毒性的方法。3-MCPD双酯占食品中3-MCPD酯含量的85%以上,因此本研究选择其中具有代表性的3-MCPD棕榈酸双酯(3-MCPD dipalmitate)作为目标化合物,在明确其肾毒性作用基础之上,首先通过高分辨质谱技术阐明其毒代谢动力学,再结合非靶向代谢组学技术研究代谢组学变化,筛选出用于3-MCPD酯肾毒性早期诊断的生物学标志物:1、首先明确3-MCPD dipalmitate的肾毒性作用。结果表明,3-MCPD dipalmitate激活受体相互作用蛋白(RIPK1)、RIPK3和混合谱系激酶结构域蛋白(MLKL)引起肾近端小管上皮细胞程序性坏死和炎症,从而导致肾毒性。对肾组织进行miRNA高通量测序和生物信息学分析,发现3-MCPD dipalmitate导致了38条已知miRNA和40条新型miRNA差异表达,其中miR-223-3p在小鼠肾组织中的表达显著增加。双荧光素酶报告基因实验证明,miR-223-3p靶向结合RIPK3的3′非编码区(3′UTR)并显著抑制RIPK3表达。说明miR-223-3p靶向调控RIPK3表达从而影响3-MCPD dipalmitate导致的肾毒性。2、通过高分辨质谱分析技术,考察3-MCPD dipalmitate的毒代谢动力学。Sprague Dawley(SD)大鼠灌胃3-MCPD dipalmitate(1.6g/kg BW)后,其吸收的毒代谢动力学参数为:血浆峰浓度(C_(max))为135.00 ng/mL、达峰时间(T_(max))为2.5 h、消除半衰期(T_(1/2))为3.87h、平均停留时间(MRT)为5.08 h、清除率(CL)为3.50 L/h/g、分布容积(V_d)为21.34 L/g、血浆浓度-时间曲线下的总面积(AUC_(0-∞))为458.47 h ng/mL;3-MCPD dipalmitate广泛分布于SD大鼠的组织和体液中,并且可以通过血-脑屏障和血-睾丸屏障;在SD大鼠体内总共鉴定出17个3-MCPD dipalmitate的代谢物——其中16个是首次鉴定出的代谢物——这些代谢物是3-MCPD dipalmitate在动物体内发生I相反应(水解、脱氯等分解反应)和II相反应(谷胱甘肽结合、氨基酸结合、硫酸结合等结合反应)的产物。3-MCPD dipalmitate在SD大鼠体内的排泄规律为:3-MCPD dipalmitate在体内产生I相代谢物,一部分I相代谢物与内源性化合物结合后其水溶性增强从而促进其经尿液排泄,另一部分I相代谢物与脂肪酸等物质结合后经粪便排出。但是,3-MCPD dipalmitate及其代谢物在体内含量低且停留时间短,不能作为3-MCPD酯肾毒性早期诊断的生物学标志物。3、通过高分辨质谱结合非靶向代谢组学分析,筛选3-MCPD dipalmitate肾毒性早期诊断的生物学标志物,在血浆中鉴定出12个生物学标志物:indoxyl sulfate、phenol sulphate、p-cresol sulfate、2-phenylethanol glucuronide、p-cresol glucuronide、p-cresol、allantoin、phenylacetylglycine、pyrocatechol sulfate、phenyllactic acid、5-hydroxyindoleacetic acid和creatinine。结合肾、肝、睾丸、脾四个主要器官的非靶向代谢组学分析,结果显示:3-MCPD dipalmitate肾毒性主要影响了SD大鼠的氨基酸(phenylalanine、tryptophan、tyrosine和glycine)、脂肪酸、嘌呤的代谢以及肠道微生物的代谢,导致血浆中这12个生物学标志物含量显著增加。这些生物学标志物在体内稳定性高、灵敏度高且变化显著,因此,可作为3-MCPD dipalmitate肾毒性早期诊断的生物学标志物。
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
【图文】：

字母,氮水平,生化指标,肌酐

mitate 对小鼠体重的影响（n = 6）。不同字母代表CPD dipalmitate on body weight in mice (n = 6). Dsignificant differences at P < 0.05定结果表明，单次灌胃 3-MCPD dipalmit素氮水平升了 5.18 倍（图 2-2A）；血清图 2-2B）。itate 引起的 C57BL/6 小鼠血清生化指标的变化（（B）肌酐。不同字母代表差异显著（P < 0.05）try parameters change in C57BL/6 mice exposed to 3, (B) Creatinine. Different letters represent significan

尿素氮,生化指标,肌酐,小鼠血清

初榨橄榄油）24 h 后显著升高，升高了 2 g（8.93%）。在给予 3-MCPD dipalmit后，C57BL/6 小鼠开始一系列中毒反应，包括立毛、拉肚、行动迟缓、抽搐等24 h 内未观察到 C57BL/6 小鼠死亡。图 2-1 3-MCPD dipalmitate 对小鼠体重的影响（n = 6）。不同字母代表差异显著（P < 0.05）Fig. 2-1 Effect of 3-MCPD dipalmitate on body weight in mice (n = 6). Different letters represensignificant differences at P < 0.05血液生化指标测定结果表明，单次灌胃 3-MCPD dipalmitate 2.5 g/kg BW, 24后实验组大鼠血清尿素氮水平升了 5.18 倍（图 2-2A）；血清肌酐水平相对于对组上升了 5.77 倍（图 2-2B）。

评价体系,毒性,病理,放大倍数

图 2-3 3-MCPD dipalmitate 引起 C57BL/6 小鼠肾毒性（n = 6）：（A）HE 染色（放大倍数 200），（B）肾病理变化评分基于 0-5 级 Jablonsky 病理评价体系。不同字母代表差异显著（P < 0.05）Fig. 2-3 3-MCPD dipalmitate-induced nephrotoxicity in C57BL/6 mice (n = 6). (A) hematoxylin andeosin staining (200×magnification), (B) Histologic damage graded based on 0-5 Jablonsky gradingscale. Different letters represent significant differences at P < 0.05肾组织透射电镜（TEM）分析结果表明，与对照组相比，3-MCPD dipalmitate组肾近端小管上皮细胞出现细胞膜损坏、线粒体脊消失和膨胀、核膜消失、细胞内容物消失等坏死的特征（图 2-4），说明 3-MCPD dipalmitate 引起的肾损伤主要表现为肾近端肾小管细胞坏死。

【参考文献】