CypA在肺泡巨噬细胞泡沫化调节矽肺纤维化形成中的作用研究

发布时间：2020-08-14 07:34

【摘要】：目的探讨亲环素A(CypA)在游离二氧化硅(SiO_2)诱导巨噬细胞泡沫化中的作用及其作用机制,从而进一步研究巨噬细胞泡沫化对矽肺纤维化的影响。方法第一阶段实验,使用100 ng/ml的豆蔻酸佛波醇乙酸酯(PMA)将处于对数期生长的人周围血单核细胞(THP-1),诱导分化为THP-1源性的巨噬细胞,培养48 h后,分为4个实验组:空白对照组细胞不做任何处理,给与ox-LDL对照组的培养基含终质量浓度50μg/ml的ox-LDL的培养基,给与50μg/ml SiO_2组的培养基含终质量浓度50μg/ml的SiO_2和50μg/ml ox-LDL的培养基,给与100μg/ml SiO_2组的培养基含终质量浓度为100μg/ml的SiO_2和50μg/ml的ox-LDL,培养48 h后,通过MIC测试条法检测细胞活力,通过油红O染色法和胆固醇试剂盒法观察巨噬细胞脂质蓄积的情况,酶联免疫吸附实验法检测巨噬细胞上清液中CypA表达情况,以蛋白质印迹法检测细胞中CypA表达的情况。第二阶段实验,用同样的方法建立泡沫细胞模型,采用慢病毒转染使CypA过表达,设立组别为空白对照组(Control,不做任何处理),过表达组(OE,过表达病毒),阴性对照组(NC,100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL+对照病毒),过表达实验组(OE+T,100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL+过表达病毒);采用基因沉默的方法使CypA低表达,设立组别为对照组(Control,不做任何处理),SiCypA组(SiCypA),阴性对照组(NC,NC+100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL),SiCypA实验组(SiCypA+T,SiCypA+100μg/ml SiO_2+50μg/mlox-LDL),培养48h。采用第一阶段的方法检测CypA的表达变化以及泡沫化情况。在第三阶段,基于亲环蛋白A的过表达,CD36途径被阻断,细胞随机分为以下四个实验组:对照组(DMSO),SSO抑制剂组(5μM SSO),模型组(DMSO+SiO_2+ox-LDL)以及SSO实验组(SSO+SiO_2+ox-LDL),每个组培养48h。使用与第一阶段相同的方法观察细胞泡沫化情况。将第一、二、三阶段的各组别细胞的上清培养人肺成纤维细胞(HFL-1),蛋白质印迹法检测细胞中胶原蛋白1(COLⅠ)和a平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平。结果1 MTS结果显示:与对照组比较,SiO_2质量浓度为100μg/ml时细胞活力最强。2油红O染色结果显示,与空白对照组相比,100μg/ml SiO_2组细胞泡沫样变化显着。3与空白对照组比较,ox-LDL对照组、50μg/ml SiO_2组、100μg/ml SiO_2组细胞内TC、FC表达水平均升高(P0.01),且CE比重增加(P0.01)。4CypA在细胞内表达水平均降低(P0.01),上清液中CypA表达水平均升高(P0.01)。5 CypA过表达模型构建成功后,与NC相比,细胞上清液中CypA表达明显增多(P0.01),油红O染色结果显示,OE+T组细胞橘红色色脂滴明显增多;与NC组相比,OE+T组细胞内TC、FC表达水平均升高(P0.01),且CE比重增加(P0.05)。6巨噬细胞中CypA基因沉默后,与NC组相比,上清液中CypA表达降低(P0.01);SiCypA+T组橘红色脂滴明显减少,与NC组相比,SiCypA+T组细胞内TC、FC表达水平均降低(P0.01),且CE比重减少(P0.05)。7亲环蛋白A过表达模型中CD36蛋白的表达也增加(P0.01),SSO抑制剂阻断CD36通路后,结果显示,与DMSO+T组相比,SSO+T组细胞内橘红色脂滴明显减少,TC、FC表达水平均降低(P0.01),且CE比重减少(P0.05)。8用各组上清液刺激人肺成纤维细胞(HFL-1),结果显示,与空白对照组相比,100μg/ml SiO_2组,COLⅠ和α-SMA蛋白水平均升高(P0.05);与NC组相比,OE+T组COLⅠ和α-SMA蛋白水平均升高(P0.05);与NC组相比,SiCypA+T组COLⅠ和α-SMA蛋白水平均降低(P0.05)。结论1 CypA在巨噬细胞泡沫化过程中的表达发生变化。2 CypA在巨噬细胞泡沫化过程中发挥一定作用。3 CypA发挥作用过程可能与介导CD36表达有关。4巨噬细胞泡沫化可介导矽肺纤维化过程。图32幅;表12个;参139篇。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R135.2
【图文】：

空白对照组；B：ox-LDL 对照组；C：50 μg/ml SiO2组；D：100 μg/ml SiO2组；箭头所示为脂质颗粒环状。图 2 各组巨噬细胞油红 O 染色情况（×400）Fig.2 macrophages oil red O staining of each group (×400)

A：空白对照组；B：ox-LDL 对照组；C：50 μg/ml SiO2组；D：100 μg/ml SiO2组图 5 CypA 在巨噬细胞中表达的情况Fig.5 Expression of cyclophilin A in macrophages***

A：NC 组；B：OE+T 组；C：NC 组；D：OE+T 组图 8 巨噬细胞中亲环蛋白 A 的表达Fig.8 Expression of cyclophilin A in macrophages

【参考文献】

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本文编号：2792716