LncRNA-ATB竞争性吸附miR-200c调控EMT促进矽尘诱导肺纤维化的机制研究

发布时间：2020-08-20 13:12

【摘要】：矽肺病(silicosis)是一种不可逆转的以纤维化为特征的肺部疾病,是最常见、进展最快、危害最严重的尘肺病类型。矽肺作为职业病给发展中国家带来沉重的社会负担,严重危害职业人群的生存质量。在生产过程中,吸入的二氧化硅粉尘进入肺内,直接或间接作用于不同类型的效应细胞,起始阶段以炎症为主,逐渐过渡到以纤维化为主。矽肺病的发生涉及到一个多层面、多阶段、多种细胞、大量炎性因子、致纤维化因子、相关基因与调节基因表达分子等共同参与并相互影响形成的复杂调控网络。矽肺病的发病机制复杂,尚未完全清楚,制约了有效的预防和治疗。因此,深入研究矽肺病的发病机制具有重大的经济和社会价值。上皮细胞间质转化(EMT)在多种疾病发生发展中具有重要意义。主要表现为上皮细胞极性消失,失去与基底膜连接,从而获得转移和侵袭能力,同时细胞骨架发生重组,细胞形态变为纺锤形。在此过程中细胞粘附分子E-cadherin表达减少,成纤维细胞或间质细胞特性突显,如Vimentin、N-cadherin、Snail及其他间质细胞蛋白表达上调,同时细胞分泌多种促纤维化因子包括I型胶原(Col I)和CTGF等。肺上皮细胞发生EMT是肺纤维化进程中的重要生物学事件,主要通过激活成纤维细胞/肌成纤维细胞,加速胶原沉积,促进肺纤维化的发生。然而,在肺纤维化过程中EMT进程的具体作用机制还不完全清楚。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类不具有蛋白编码能力的长RNA转录本,广泛参与细胞进程中的各个层面。现有的研究认为lncRNA的表达水平异常与多种人类疾病的发生发展与预后关系密切,因此,失调的lncRNA可能是包括肺纤维化在内多种疾病的重要生物学标志。LncRNA的作用方式多样,在基因表达的转录、翻译及翻译后修饰水平均发挥重要作用。目前,lncRNA作为竞争Qg源性RNA(ce RNA),通过“海绵”吸附机制结合microRNA(miRNA)受到了广泛的关注。也就是说除了传统的miRNAs通过促进mRNA降解和抑制转录后翻译这两种沉默靶基因机制之外,还存在着反向的非编码RNA调控miRNA的作用方式,即lnc RNA与mRNA竞争性结合miRNA从而起到交互作用。目前lncRNA作为ceRNA在肿瘤中的作用研究报道较多,在特发性肺纤维化(IPF)中也有少量报道。此外,我国科学家检测了煤工尘肺患者血浆lncRNA-ATB水平,发现煤工尘肺患者血浆中lncRNA-ATB水平明显高于正常人群,并且与TGF-β1水平呈正相关关系。我们使用TGF-β1处理肺上皮细胞也发现lncRNA-ATB表达升高,并且伴随细胞EMT进程的发生。进一步使用siRNA敲低lncRNA-ATB后则显著阻滞了TGF-β1诱导的EMT。为了验证LncRNA-ATB对EMT的调控作用是否通过ceRNA形式产生,我们在TGF-β1处理的Beas-2B细胞中敲低lncRNA-ATB做miRNA芯片筛检。通过芯片验证和生物信息学分析我们发现miR-200c作为受lnc RNA-ATB影响最显著的miRNA,存在与lncRNA-ATB的潜在结合位点。LncRNA-ATB在肺纤维化过程中以ceRNA形式吸附miRNA的具体作用机制尚不清楚,因此,我们的研究探讨了矽尘诱导肺纤维化过程中lncRNA-ATB参与上皮细胞EMT的分子机制和调控作用,进一步寻找lncRNA-ATB以ceRNA形式吸附作用的miRNA,为早期发现矽肺病的生物标志物和治疗靶点提供强有力的科学依据。目的体外细胞实验研究在TGF-β1诱导的细胞EMT过程中明确lncRNA-ATB对其吸附miRNA的具体调控机制,确认被吸附的miRNA下游信号分子及其对EMT的作用,探寻TGF-β1的细胞来源,同时在体内整体动物水平通过高表达miRNA探索lncRNA-ATB吸附的miRNA对矽尘诱导肺纤维化进程的影响,进一步揭示非编码RNA调控EMT进程在矽肺中的分子机制。方法同时选取人肺泡II型上皮细胞A549和人支气管上皮细胞Beas-2B进行细胞研究,构建TGF-β1诱导的EMT模型;划痕实验检测细胞迁移能力,Western Blot和免疫荧光方法检测EMT相关蛋白标志物水平;核质分离方法对lncRNA-ATB进行定位;使用lncRNA-ATB siRNA转染Beas-2B细胞观察lncRNA-ATB对EMT进程的调控作用;Affymetrix GeneChip miRNA 4.0芯片筛检Beas-2B细胞中受lncRNA-ATB影响的潜在miRNA,qRT-PCR验证miRNAs水平,RT-PCR和qRT-PCR检测lncRNA-ATB水平;使用双荧光素酶报告基因和RNA pull-down方法验证lncRNA-ATB与miR-200c的结合;lncRNA-ATB siRNA和miR-200c mimic共同转染TGF-β1处理的Beas-2B细胞,观察其对miR-200c靶基因ZEB1和EMT的联合抑制作用,lncRNA-ATB siRNA和miR-200c inhibitor共同转染TGF-β1处理的Beas-2B或lncRNA-ATB高表达质粒和miR-200c mimic共同转染Beas-2B做功能挽救实验,证明lncRNA-ATB通过miR-200c作用于其靶基因ZEB1调控矽肺的EMT进程。构建C57BL/6小鼠的矽尘诱导肺纤维化模型和联合尾静脉注射miR-200c agomir干预肺纤维化模型,观察病理改变进行纤维化评分,Western Blot检测纤维化和EMT指标,免疫组化检测胶原I表达水平,羟脯氨酸含量检测肺纤维化程度,体内验证miR-200c对矽肺的干预作用。佛波酯(PMA)诱导人单核细胞THP-1分化成巨噬细胞,矽尘处理巨噬细胞后ELISA检测TGF-β1分泌情况;流式细胞分选出M2型巨噬细胞与Beas-2B细胞做共培养,观察Beas-2B细胞形态和指标变化,检测lncRNA-ATB及miR-200c水平,寻找lncRNA-ATB在矽肺进程中的肺上皮细胞表达升高的来源。结果1.升高的lncRNA-ATB参与调控肺上皮细胞EMT进程首先,我们在A549和Beas-2B细胞中通过分别使用0、1、2、5 ng/mL的TGF-β1处理细胞24或48 h构建细胞EMT模型,根据细胞形态、迁移能力和EMT指标发现5 ng/mL TGF-β1处理48 h细胞改变作为明显,因此在后续实验中选取该剂量诱导细胞EMT。随后在EMT细胞模型中检测lncRNA-ATB,发现其表达水平随着TGF-β1处理时间和剂量的增加而升高,提示lncRNA-ATB可能参与肺上皮细胞EMT进程。在TGF-β1处理的细胞中使用特异性siRNA敲低lncRNA-ATB,与EMT组细胞相比发现上皮细胞标志物E-cadherin表达回升,间质指标Vimentin、ZEB1和纤维化指标Fibronectin和α-SMA表达下降,说明敲低lncRNA-ATB缓解了EMT进程,证实了lncRNA-ATB对肺上皮细胞EMT的调控作用。2.LncRNA-ATB在EMT进程中直接结合吸附miR-200c为了明确lncRNA-ATB发挥调控EMT作用的分子机制,通过核质分离实验寻找其潜在作用机制。结果表明lncRNA-ATB主要分布于细胞质中,该特征是lncRNA发挥ceRNA作用的生物学保障,因此我们主要关注了lncRNA-ATB的ceRNA作用方式。通过对TGF-β1和TGF-β1+lncRNA-ATB siRNA处理的Beas-2B细胞做miRNA芯片筛选,联合qRT-PCR验证发现变化倍数超过2倍且细胞丰度较高的7种mi RNAs,进一步选取变化最为显著且具有潜在lncRNA-ATB结合位点的miR-200c进行下一步研究。在细胞EMT模型中发现miR-200c高表达对EMT进程起到与lncRNA-ATB敲低相类似的阻滞作用,说明miR-200c参与肺上皮细胞EMT。生物信息学网站预测联合双荧光素酶报告基因实验、RNA pull-down实验共同证明了lncRNA-ATB对miR-200c的直接结合吸附作用。3.miR-200c缓解矽尘诱导的肺纤维化为了在体内进一步验证miR-200c参与矽肺进程,我们通过构建矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型,选取0、7、14、28天的小鼠肺组织检测miR-200c水平。结果显示随着时间的延长,免疫组化发现胶原I水平逐渐升高,Western Blot检测上皮细胞标志物E-cadherin表达降低,间质指标Vimentin、ZEB1和纤维化标志物Fibronectin和α-SMA表达升高,与此同时,miR-200c水平逐渐下降。接下来我们使用miR-200c agomir在小鼠体内高表达miR-200c观察其干预效果。发现与矽尘联合miR-NC agomir处理组相比,矽尘联合mi R-200c agomir成功升高了小鼠肺内的miR-200c水平,肺组织病理切片后做HE染色及肺纤维化评分说明miR-200c agomir成功减轻了矽尘诱导小鼠发生的肺纤维化程度,相关的EMT和纤维化指标也支持该结论。4.LncRNA-ATB通过miR-200c靶向ZEB1调控肺上皮细胞EMT前期大量研究表明miR-200c可以通过靶向ZEB1这一EMT诱导因子3’UTR区参与调控细胞的EMT进程。因此,我们直接联合使用TGF-β1和miR-200c mimic分别或共同处理Beas-2B细胞,发现高表达miR-200c之后ZEB1的mRNA和蛋白水平均明显降低,双荧光素酶报告基因实验则证实了miR-200c对ZEB1的直接靶向作用。在明确了lncRNA-ATB直接结合吸附miR-200c,miR-200c靶向ZEB1的基础上,通过联合抑制和功能挽救实验证实其上下游关系。首先在细胞EMT模型中,单独或联合使用lncRNA-ATB siRNA和miR-200c mimic,结果发现lncRNA-ATB水平降低,联合处理后miR-200c上升,对ZEB1的mRNA和蛋白水平抑制作用更为明显,相关指标揭示低表达lncRNA-ATB的同时高表达miR-200c对TGF-β1诱导的细胞EMT进程抑制最为显著,起到联合抑制作用。再在细胞EMT模型中单独或联合使用lncRNA-ATB siRNA和miR-200c inhibitor,qRT-PCR检测发现miR-200c inhibitor可以降低lncRNA-ATB低表达对miR-200c水平的升高作用,并且联合处理组与lncRNA-ATB siRNA单独处理组相比,靶基因ZEB1和EMT指标水平回升;与之类似的是,在正常Beas-2B细胞中使用质粒高表达lncRNA-ATB促进EMT指标升高,而同时使用miR-200c mimic处理后指标回降,这些结果说明mi R-200c作为lncRNA-ATB的下游可以回复lncRNA-ATB对EMT的促进作用。以上结果明确了lncRNA-ATB通过miR-200c作用于其靶基因ZEB1影响肺上皮细胞的EMT进程。5.矽尘刺激巨噬细胞分泌TGF-β1促进肺上皮细胞发生EMT在矽尘诱导肺纤维化的过程中,巨噬细胞可以分泌大量的TGF-β1在细胞微环境中发挥重要促纤维化作用。为了追溯影响肺上皮细胞中lncRNA-ATB水平的上游来源,我们使用0~200μg/mL的SiO_2悬浮液处理PMA诱导的巨噬细胞。结果显示150μg/mL SiO_2处理的巨噬细胞合成和分泌的TGF-β1水平最高。通过使用SiO_2处理的巨噬细胞的培养液上清液继续培养Beas-2B细胞,发现lncRNA-ATB水平升高,miR-200c降低,同时Beas-2B细胞发生EMT。为了确证该作用是M2型巨噬细胞通过分泌TGF-β1实现的,我们在SiO_2处理的巨噬细胞培养液饲养Beas-2B细胞的同时加入TGF-β1抑制剂SB 431542,结果发现以上促EMT作用完全消失,并且lncRNA-ATB和miR-200c水平回复正常。鉴于M2型巨噬细胞是分泌TGF-β1的主要巨噬细胞类型,我们进一步通过CD206这一M2型巨噬细胞特异性抗原分选SiO_2处理的巨噬细胞,收集筛选出的M2巨噬细胞。M2巨噬细胞与Beas-2B的共培养也明显促进了肺上皮细胞发生EMT,并且在升高lncRNA-ATB水平的同时降低miR-200c水平。这部分结果主要说明了SiO_2作用于巨噬细胞促使其极化成为M2型巨噬细胞,分泌TGF-β1进入细胞微环境,促进肺上皮细胞中lncRNA-ATB的升高从而发挥促EMT功能。结论本研究通过体内外实验证明在矽尘诱导的肺纤维化过程中,巨噬细胞在SiO_2刺激下分泌出大量的TGF-β1,TGF-β1进入肺上皮细胞促进lncRNA-ATB表达升高,通过结合吸附的方式降低游离miR-200c水平,释放miR-200c的靶基因ZEB1,从而促进矽尘诱导肺纤维化进程中肺上皮细胞EMT的发生发展。该课题有助于完善矽肺过程中lncRNA-ATB相关的具体作用分子机制和相关调控网络。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R135.2
【图文】：

指标,细胞,肺腺癌细胞系,划痕实验

采用了 TGF-β1 诱导的方法处理肺上皮细胞。A549 是人肺泡 II 型上皮细胞，如图 1 所示，使用 0、1、2、5 ng/mL 的人重组 TGF-β1 处理 A549 细胞 24 或 48 h，蛋白结果检测上皮细胞标志物 E-cadherin，发现其表达随着 TGF-β1 浓度的增加和处理时间的增长逐步降低，与之相法，间质指标 Vimentin 和 ZEB1 的表达呈现整体上升趋势，并且在 5 ng/mL 的 TGF-β1 处理时达到最高水平，说明 A549细胞成功发生 EMT。然而考虑到 A549 同时也是肺腺癌细胞系，可能与正常状态的细胞信号通路存在一定差异，因此，我们同时使用 0、1、2、5 ng/mLTGF-β1处理人正常支气管上皮细胞系 Beas-2B 48h，得到了与 A549 细胞相类似的结果。此外，我们还应用 TGF-β1 处理原代的肺泡 II 型上皮细胞，EMT 指标得到了升高作用（图 1）。为了进一步证明细胞确实发生了 EMT，我们还通过划痕实验检测了细胞的迁移能力（图 2），发现 5 ng/mLTGF-β1 处理 48h 的 A549 和 Beas-2B细胞迁移能力增加最为明显。因此，使用该 TGF-β1 处理剂量时间在后续实验中诱导细胞发生 EMT。

柱状图,细胞迁移,间隙扫描,ImageJ软件

南京医科大学博士学位论文Western Blot 方法检测（A）0、1、2、5 ng/mL TGF-β1 处理 A549 细胞 24、h，（B）处理 Beas-2B 细胞 48 h 和（C）人原代肺泡 II 型上皮细胞 48 h 后adherin、Vimentin 及 ZEB1 蛋白表达水平，柱状图为 Image J 软件对条带灰度定量结果（n=3）。*P<0.05 与正常对照组比有统计学差异。

医科大,功能验证,细胞系,上皮

南京医科大NA-ATB 的表达情况，结果发现 lncRNA-ATB 表达水平高而升高（图 3）。揭示了 lncRNA-ATB 可能参与了肺上皮论证这一观点，我们构建了三种针对 lncRNA-ATB 的 s检测发现 lncRNA-ATB siRNA1 在两种细胞系中对 TB 升高的回降效率都是最高的，因此被用作后续功能验证

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