NANOG在过氧化氢诱导人毛囊间充质干细胞损伤的保护作用及机制研究

发布时间：2020-08-21 08:20

【摘要】：目的过氧化氢(Hydrogen Peroxide,H2O2)是目前常用染发剂的主要成分之一,可损伤毛发。人毛囊毛乳头部位含有丰富的毛囊间充质干细胞(Hair Follicle Mesenchymal Stem Cells,HF-MSCs),HF-MSCs参与毛囊发生、毛囊周期循环和毛囊再生等重要过程。NANOG(The Transcription Factor of Embryonic Stem Cells,胚胎干细胞转录因子)是一种维持干细胞自我更新和多潜能分化的核心转录因子,在促进间充质干细胞增殖、维持未分化状态中发挥重要作用,但作用机制尚不十分清楚。本研究旨在通过探讨NANOG对HF-MSCs细胞生物学行为的影响并明确作用机制,利用H2O2建立HF-MSCs损伤模型,从而探讨NANOG对H2O2诱导HF-MSCs损伤的保护作用及机制,为毛囊再生及毛囊损伤修复的研究提供理论依据。方法1.第一部分实验中,首先通过拔取毛发结合组织块培养法从人毛囊组织中分离获取HF-MSCs。通过免疫荧光染色和流式细胞术鉴定间充质干细胞表面标志,茜素红S和油红O染色鉴定成骨、成脂分化潜能。利用慢病毒包装方法将携带NANOG编码序列的载体转导HF-MSCs。通过绘制生长曲线、流式细胞术检测细胞周期、衰老β-半乳糖苷酶染色检测细胞衰老、Western Blot检测PARP1、AKT、p-AKT、ERK和p-ERK蛋白表达,探讨NANOG对HF-MSCs细胞生物学行为的影响。通过Western Blot检测蛋白表达并结合双萤光素酶报告基因检测,探讨NANOG和PBX1的调控关系。此外,通过RNA干扰技术敲减PBX1和AKT以及加入PI3K/AKT抑制剂LY294002,探讨NANOG、PBX1和AKT三者之间的关系。2.第二部分给予HF-MSCs一定剂量H2O2后,CCK-8法检测细胞存活率、镜下观察细胞形态学改变、荧光探针检测细胞内ROS水平及Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡率。Western Blot法检测AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、PARP1和Caspase-3蛋白表达。3.第三部分通过检测H2O2处理后细胞存活率、细胞内ROS水平、细胞凋亡率,探讨NANOG是否具有保护作用,Western Blot检测AKT、p-AKT、PARP1蛋白,利用PI3K/AKT抑制剂LY294002和RNA干涉敲减PARP1(116 k Da)后,检测细胞存活率、细胞内ROS水平明确NANOG减轻H2O2对HF-MSCs损伤的机制。结果1.异位表达NANOG对HF-MSCs细胞生物学影响(1)分离获取HF-MSCs,其表达间充质干细胞表面标志CD105、CD90、CD73、CD44,并具有成骨、成脂分化潜能。(2)细胞生长曲线第6天和第8天结果发现,异位表达NANOG和过表达PBX1细胞数明显多于对照组(Vector组);细胞周期结果发现,异位表达NANOG和过表达PBX1减少G0/G1期阻滞,增加S期;NANOG组和PBX1组增殖指数高于对照组。(3)NANOG组和PBX1组钙盐结节形成比例均多于对照组;NANOG组和PBX1组脂滴形成均少于对照组。(4)第6代和第14代NANOG组和PBX1组衰老细胞阳性率明显低于对照组。(5)Western Blot结果发现,和对照组比较,NANOG组和PBX1组PARP1(116 k Da)表达上调、p-AKT表达增加且p16、p53、p21表达下降。(6)NANOG异位表达的PBX1蛋白表达明显高于对照组;通过双萤光素酶报告基因检测发现,NANOG组萤光素酶活性明显高于对照组。(7)NANOG异位表达后敲减PBX1显著下调p-AKT表达并增加衰老细胞阳性率。(8)NANOG异位表达后加入PI3K/AKT抑制剂LY294002显著下调p-AKT表达和PBX1表达并增加衰老细胞阳性率。(9)NANOG异位表达后敲减AKT显著下调PBX1、p-AKT和AKT表达并增加衰老细胞阳性率。2.H2O2对HF-MSCs的损伤作用及机制(1)通过CCK-8法检测不同浓度(0μM、100μM、200μM、400μM、800μM)H2O2处理2 h和400μM H2O2处理不同时间(0 h、1 h、2 h、4 h、6 h)细胞存活率,随着H2O2处理浓度升高和H2O2作用时间延长,细胞存活率下降明显。(2)不同浓度H2O2处理2 h,随着浓度升高,镜下观察细胞逐渐失去正常形态,存活细胞数目减少;荧光探针检测发现细胞内ROS水平逐渐升高;Annexin V-FITC/PI法检测发现细胞凋亡率明显升高。(3)Western Blot结果显示,随着浓度增加,p-AKT表达先升高后下降,p-ERK表达逐渐下降,cleaved caspase-3表达明显增多,PARP1(116 k Da)表达下降,PARP1(89 k Da)表达上调;随着时间增加,p-AKT表达下降,p-ERK表达下降,cleaved caspase-3表达明显增多,PARP1(116 k Da)表达下降,PARP 1(89 k Da)表达上调。3.NANOG对H2O2致HF-MSCs损伤的保护作用及机制(1)NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组细胞存活率明显高于Vector-H2O2组,ROS水平明显低于Vector-H2O2组。(2)Vector-H2O2组细胞凋亡率明显高于对照组;NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组细胞凋亡率均低于Vector-H2O2组。(3)NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组p-AKT表达明显高于Vector-H2O2组;加入PI3K/AKT抑制剂LY294002,NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组细胞存活率高于抑制剂LY294002组且ROS水平低于抑制剂LY294002组。(4)NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组PARP1(116 k Da)表达明显高于Vector-H2O2组;Vector-H2O2组PARP1(89 k Da)表达明显高于对照组。通过RNA干涉敲减PARP1(116 k Da),NANOG-H2O2组和PBX1-H2O2组细胞存活率高于敲减组且ROS水平低于敲减PARP1组。结论1.NANOG通过PBX1上调p-AKT促进人毛囊间充质干细胞增殖并延缓衰老,且PBX1和AKT之间存在双向调控。2.H2O2作用降低p-AKT和p-ERK表达,增加cleaved caspase-3和PARP1(89 kDa)表达,引起人毛囊间充质干细胞损伤。3.NANOG通过PBX1上调p-AKT和PARP1(116 k Da)减轻H2O2引起的人毛囊间充质干细胞损伤。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

细胞类型,毛乳头,毛囊,可分

图 2.1.1.2 毛囊及毛乳头可分化的细胞类型[14]（The Hair Follicle: An Underutilized Source of Cells and Materials for RegenerativeMedicine. ACS Biomater Sci Eng, 2018, 4(4): 1193-1207.）

示意图,干细胞,外胚层,小鼠

吉林大学博士学位论文12图2.3.1.1 人 ESCs 和小鼠外胚层干细胞 NANOG、OCT4、SOX2 调控示意图[18]NANOG 在不同细胞中维持自我更新和多潜能性所涉及的信号通路不同。Cheng 等[67]研究表明 NANOG 可通过下调 Wnt 信号调控大鼠表皮间充质干细胞增殖和分化；Munst 等[59]认为 NANOG 可通过下调 p27KIP1表达促进人成纤维细胞增殖；Kim 等[68]认为 NANOG 介导的 ERK 信号通路对维持胚胎干细胞自我更新和 NANOG 蛋白表达稳定性至关重要。此外，Juhee 等[19]认为 NANOG 能逆转BM-MSCs 衰老，促进其增殖和提高成肌分化潜能；Panagiotis 等[21]研究表明，NANOG 通过激活 TGF-β 和 ROCK 通路引起 ACTIN 磷酸化、MRTF-A 核移位以及 SRF 依赖的成肌基因表达，逆转衰老干细胞成肌分化潜能。上述研究表明，NANOG 在不同细胞中维持自我更新和多潜能性的调控通路不尽相同。2.3.2 NANOG 在衰老和重编程方面的作用众所周知，干细胞治疗需要体外连续培养大量扩增干细胞，可造成干细胞发生复制性衰老进而自我更新和多潜能分化能力下降，严重限制其临床应用，因此有关延缓干细胞衰老的研究具有重要意义[69]。细胞衰老的标志包括细胞形态学改变、细胞周期阻滞、衰老 β-半乳糖苷酶活性增加和衰老相关蛋白（p16INK4a、p53和 p21CIP/WAF）表达上调等。Andreadis 团队一系列研究表明，NANOG 异位表达可延缓 BM-MSCs 衰老并促进其成肌分化潜能[19-21, 64]。Munst 等[59]研究表明

质粒图谱,慢病毒,质粒提取,离心管

图 3.2.2 慢病毒包装 NANOG、PBX1、Vector 质粒图谱3.2.2.1 质粒提取及浓度测定（1）摇菌：50 mL 离心管中加入 10 mL 灭菌的 LB 培养基 12 mL、氨苄抗

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