亚硝酸盐暴露对小鼠学习记忆及突触发育的影响

发布时间：2017-04-01 13:00

  本文关键词：亚硝酸盐暴露对小鼠学习记忆及突触发育的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：亚硝酸盐,一类亚硝酸无机化合物的总称,以亚硝酸钠为主。机体内硝酸盐在口腔和胃内细菌作用下也转化为亚硝酸盐。亚硝酸钠为白色颗粒或粉末状,易溶于水,并在造纸业、建筑业中广泛使用,食品中也允许作为添加剂限量使用。人体摄入0.3~0.5g的亚硝酸盐就可引起中毒甚至死亡,机体长期摄入亚硝酸盐主要会引起高铁血红蛋白血症、上消化道肿瘤、先天畸形等结局,而亚硝酸盐暴露对中枢神经系的研究较少,尤其是对学习记忆的影响更是少见。还有资料表明,硝酸盐和亚硝酸盐在机体内的重要代谢产物---亚硝酰胺中甲基及乙基亚硝基脲可以使大鼠、小鼠等实验动物子代产生中枢神经系统和骨骼系统的畸形,我们推测孕期亚硝酸盐暴露也可能对子鼠中枢神经系统中突触的发育产生损害,所以本研究分两部分从突触出发观察亚硝酸盐暴露下学习记忆的改变情况。其中第一部分:对成年小鼠进行亚硝酸盐暴露后检测小鼠学习记忆的改变并对其机制进行探讨;第二部分:对孕期小鼠进行亚硝酸盐暴露观察子鼠视皮质区突触的发育情况并对其机制进行分析。通过两部分研究更加系统地分析亚硝酸盐暴露对学习记忆能力的改变情况,加强研究的真实可信性。目的:探讨亚硝酸盐暴露下小鼠学习记忆的改变及孕期亚硝酸盐暴露对子代突触发育的影响。方法:本研究第一部分应用6g·L-1亚硝酸盐溶液对63只4~6周龄健康雄性C57BL/6J小鼠持续灌胃3个月,以建立亚硝酸盐暴露模型(低剂量组暴露剂量为60mg·kg-1,高剂量组暴露剂量为120mg·kg-1,对照组采用生理盐水灌胃)观察亚硝酸盐暴露对小鼠学习记忆能力的改变情况,并对其改变机制进行初步探讨;第二部分则选取7~10周龄成年健康C57BL/6J小鼠,雌鼠63只(未生育),雄鼠22只,雌雄小鼠1∶1合笼交配(16:00),次日8∶00检查阴道栓塞情况。如发现雌鼠阴道存在栓子则将该鼠视为已受孕并将该日定为妊娠第1天(embryonic day 0,E0)。确定妊娠当日分离出雄鼠,妊娠雌鼠单笼照常饲养。从E0开始对妊娠雌鼠进行亚硝酸盐暴露处理(低剂量组暴露剂量为60 mg·kg-1,高剂量组暴露剂量为120mg·kg-1,对照组采用生理盐水灌胃)直至生产,完成孕期亚硝酸盐暴露模型的建立。模型建立后,分别用Morris水迷宫检测行为学的改变,利用免疫荧光染色观察突触素(Synaptophysin)和突触核蛋白(γ-Synuclein)的改变,并用western blot技术对Synaptophysin进行进一步的检测。结果:第一部分水迷宫实验中前2天的获得性实验中各组小鼠逃逸潜伏期比较长且没有统计学差异(P0.05)。第3天开始亚硝酸盐暴露组小鼠逃逸潜伏期延长且与亚硝酸盐有剂量依赖关系(P0.05)。对比小鼠第7天运动轨迹发现,对照组小鼠找到平台的路程最短,而高剂量组小鼠探寻平台路程轨迹明显延长且复杂化。在第8天的探查性实验中发现,模型组小鼠与对照组相比,模型组小鼠在目标象限停留时间和穿越平台次数均减少且与亚硝酸盐暴露剂量存在依赖关系(P0.05)。各组小鼠视皮质突触数密度(个/μm2)进行测量时经统计得出,对照组突触数为4.74±0.56/μm2,低剂量组3.20±0.18/μm2,高剂量组1.89±0.28/μm2,突触核蛋白的改变情况为:对照组γ-Synuclein数为1983±65.89/mm2,低剂量组2394±77.39/mm2,高剂量组3733±175.18/mm2,因此模型组中突触数量均明显减少而γ突触核蛋白阳性细胞数增多且与亚硝酸盐暴露有剂量依赖关系(P0.05),western blot检测结果与免疫荧光结果一致。第二部分实验结果与第一部分结果相似,在免疫荧光染色实验中,模型组子鼠视皮质突触数量减少而γ突触核蛋白表达增加且与暴露剂量有依赖关系(P0.05),利用水迷宫对各组子鼠进行行为学检测发现,从实验第3天起亚硝酸盐暴露组的逃逸潜伏期则高于对照组(P0.05),低剂量组和高剂量组之间则没有明显差异(P0.05);在第8天探查性实验中,各组目标象限停留时间无统计学差异(P0.05),提示孕期亚硝酸盐暴露会降低子鼠的学习能力,而对空间记忆能力的影响不明显。结论:成年小鼠亚硝酸盐暴露会降低小鼠的学习记忆能力,其机制是γ突触核蛋白的过度表达导致突触数量的减少;孕期亚硝酸盐暴露会降低子鼠的学习能力,而对空间记忆能力的影响不明显,同时孕期亚硝酸盐暴露会影响子代视皮质突触的发育,减少突触数量,对其影响具有长时程效应和剂量相关性,而γ突触核蛋白的过度表达可能是突触丢失的主要原因。
【关键词】：亚硝酸盐暴露 学习记忆 突触 γ突触核蛋白
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第一部分：亚硝酸盐暴露对成年小鼠学习记忆的影响10-34
• 1 前言10-12
• 2 仪器、试剂、材料和方法12-20
• 2.1 主要仪器12
• 2.2 主要试剂12-13
• 2.3 主要试剂的配制13-16
• 2.4 实验方法16-20
• 2.4.1 实验动物和分组16
• 2.4.2 行为学检测16-17
• 2.4.3 免疫荧光检测17-18
• 2.4.4Western Blot检测18
• 2.4.5 统计学分析18-20
• 3 结果20-28
• 3.1 亚硝酸盐暴露对小鼠行为学的影响20-22
• 3.2 亚硝酸盐暴露后突触素和 γ 突触核蛋白的表达22-28
• 4 讨论28-32
• 参考文献32-34
• 第二部分：孕期亚硝酸盐暴露对子鼠视皮质突触发育的影响34-54
• 1 前言34-36
• 2 材料与方法36-40
• 2.1 动物模型与分组36
• 2.2 免疫荧光检测36-37
• 2.3 Western blot检测37
• 2.4 行为学检测37-38
• 2.5 统计学分析38-40
• 3 结果40-48
• 3.1 孕期亚硝酸盐暴露对子鼠的影响40
• 3.2 孕期亚硝酸盐暴露对子鼠视皮质突触素和突触核蛋白的影响40-44
• 3.3Western Blot检测Synaptophysin的表达44-45
• 3.4 水迷宫检测孕期亚硝酸盐暴露后子鼠行为学的改变45-48
• 4 讨论48-52
• 参考文献52-54
• 文献综述54-62
• 参考文献59-62
• 致谢62-64
• 攻读学位期间科研情况64-65

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本文编号：280630