三氧化二砷导致小鼠非酒精性脂肪性肝炎及牛磺酸保护作用的研究

发布时间：2020-09-01 13:16

　　目的:探究三氧化二砷(As_2O_3)暴露对小鼠肝脏的损伤作用及牛磺酸保护作用的分子机制。方法:本研究以C57BL/6J小鼠为体内实验模型,以HepG2为体外实验模型。C57BL/6J小鼠经As_2O_3暴露(0、1、2及4 mg/L)及牛磺酸(250 mg/Kg)干预后,采用HE染色及油红O染色法,观察小鼠肝脏组织及脂肪变性及脂质堆积的情况;应用免疫荧光法,标记肝巨噬细胞标记标记物F4/80,检测肝巨噬细胞聚集情况;利用蛋白质印迹法检测小鼠肝组织炎症、NLRP3炎症小体和自噬相关蛋白的表达情况;依据非酒精性脂肪性肝炎(NAS)评分系统,判定As_2O_3暴露后非酒精性脂肪性肝炎得发生;利用透射电子显微镜,检测并观察As_2O_3暴露后小鼠肝组织自噬小体的改变;用免疫荧光法,检测小鼠肝组织中caspase-1活化的情况。利用MTT法检测As_2O_3对HepG2细胞的细胞增殖率的影响;应用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950,判定As_2O_3诱导的NLRP3炎症小体激活与As_2O_3导致的细胞焦亡及脂质堆积之间的关系;应用组织蛋白酶B(CTSB)抑制剂CA-074 Me,确定CTSB在As_2O_3诱导NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡当中的作用;应用自噬抑制剂3-MA,确定As_2O_3诱导的自噬与NLRP3炎症小体激活及细胞焦亡发生之间的关系;用牛磺酸预处理后,探究牛磺酸对于As_2O_3造成的非酒精性脂肪性肝炎的保护作用的分子机制。流式细胞术用于检测As_2O_3暴露后HepG2细胞焦亡数目变化;利用蛋白质印迹法检测炎症小体及自噬相关蛋白表达的变化;应用油红O染色法,观察As_2O_3暴露后HepG2细胞脂质堆积的情况。结果:体内实验:HE及油红O染色结果表明,As_2O_3暴露后的小鼠肝脏发生脂肪变性,脂质聚集增加。肝巨噬细胞表面标记物F4/80免疫荧光染色及Western blot结果表明炎症相关蛋白表达水平随着As_2O_3暴露剂量的升高而升高。NAS评分表明4 mg/L组小鼠肝脏发生非酒精性脂肪性肝炎。自噬相关蛋白LAMP-1、LC3及CTSB表达升高,p62表达水平降低,透射电镜结果发现As_2O_3暴露组出现明显自噬小体及自噬溶酶体,说明As_2O_3暴露后小鼠肝组织自噬过程被激活;炎症小体相关蛋白NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD,ASC)及caspase-1蛋白表达均升高;肝组织切片active caspase-1荧光染色结果表明,小鼠肝细胞发生焦亡。牛磺酸干预组小鼠肝脏自噬水平、炎症水平、炎症小体激活情况及细胞焦亡情况均得到改善;NAS评分降低,但是脂肪变性及脂质堆积情况并未得到改善。体外实验:As_2O_3染毒后,HepG2细胞NLRP3炎症小体相关蛋白(NLRP3、caspase-1 p20及IL-1βp17)表达升高;流式结果提示细胞焦亡百分比显著增加;应用NLRP3炎症小体抑制剂MCC950及CTSB抑制剂CA074 Me处理后,As_2O_3引起的炎症小体激活被抑制,焦亡细胞百分比明显下降;应用自噬抑制3-MA处理后,CTSB及炎症小体相关蛋白表达明显降低,焦亡细胞百分比显著下降。牛磺酸干预后,HepG2细胞自噬相关蛋白、炎症小体相关蛋白表达均被抑制,焦亡细胞百分比明显减少。与体内实验相一致的是,无论是应用MCC950、CA074 Me、3-MA处理还是牛磺酸干预后,脂质聚集增加的情况均未被改变。结论:As_2O_3暴露后,脂肪变性及脂质聚集增加,同时诱导自噬水平上调,胞浆CTSB水平增加,进而激活NLRP3炎症小体,使得IL-1β成熟,细胞炎症水平增加,发生细胞焦亡,最终导致非酒精性脂肪性肝炎;牛磺酸主要通过抑制炎症水平而不是改善脂质聚集,从而缓解As_2O_3造成的非酒精性脂肪性肝炎。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

自噬,亚显微结构,组织细胞,炎症

图 2. 牛磺酸可以抑制三氧化二砷诱导的自噬水平上调、NLRP3 炎症小体激活以及细胞焦亡的发生（A）透射电镜观察小鼠肝组织细胞亚显微结构，观察自噬小体及自噬溶酶体的变化。（B）蛋白质免疫印迹法检测小鼠肝组织自噬相关蛋白的表达及统计分析。（C）蛋白质免疫印迹法

三氧化二砷,炎症,肝细胞,HepG2细胞

图 3. 三氧化二砷导致肝细胞焦亡依赖于 NLRP3 炎症小体的激活（A）As2O3对 HepG2 细胞生存率的影响。（B）As2O3染毒后，HepG2 细胞 LDH 释放率的改变。MCC950 干预后，NLRP3 炎症小体相关蛋白的表达（C）及其统计分析、LDH 释放率的改变（D）、细胞焦亡（E）及脂质聚集（F）的变化。*表示与对照组相比 P<0.05；#表示

炎症,小体,相关蛋白,细胞

图 4. CTSB 介导三氧化二砷诱导的 NLRP3 炎症小体激活及细胞焦亡CA-074 Me 干预后，NLRP3 炎症小体相关蛋白的表达（A）及其统计分析（B-D）、亡（E-F）及脂质沉积（G-H）的变化。*表示与对照组相比P<0.05；#表示与染毒组相比P<0.

【参考文献】